פרוטוקול זה מדגים שתי שיטות חיסון להציג entomopathogen פטרייתי<em> Beauveria bassiana</em> כendophyte בשעועית המשותפת (<em> Vulgaris Phaseolus</em>), כהכנה להערכות עתידיות של דברה ביולוגית endophytic.
Beauveria bassiana הוא entomopathogen פטרייה עם היכולת ליישב צמחי endophytically. כendophyte, B. bassiana עשוי לשחק תפקיד בהגנת צמחים מתזונה צמחונית ומחלה. פרוטוקול זה מדגים שתי שיטות חיסון להקמת B. bassiana endophytically בשעועית מצויה (Phaseolus vulgaris), כהכנה להערכות עתידיות של דברה ביולוגית endophytic. צמחים גדלים מזרעי קרקע מעוקרת במשך שבועות לפני שקבל ב ' טיפול bassiana של 10 8 נבגים / מ"ל (או מים) מיושם גם כתרסיס עלים או אדמה להציף. שבועות לאחר מכן, את הצמחים נקטפים והעלים, גבעוליהם והשורשים נדגמים להעריך קולוניזציה פטרייתי endophytic. לשם כך, דגימות בנפרד משטח מעוקרות, חתוכים למקטעים מרובים, וטופחו בתקשורת אגר דקסטרוז תפוחי אדמה במשך 20 ימים. התקשורת נבדקת כל 2-3 ימים להתבונן צמיחת פטרייה כsociated עם חלקי צמח ולהקליט את המופע של B. bassiana לאמוד את ההיקף של קולוניזציה endophytic. אנליזות של הצלחת חיסון להשוות את המופע של B. bassiana בתוך חלק צמח נתון (כלומר עלים, גבעולים או שורשים) על פני טיפולים ובקרות. בנוסף לשיטת החיסון, תוצאה המסוימת של הניסוי עשויה להיות תלויה במגוון מינים או חיתוך היעד, מין entomopathogen פטרייתיים להתאמץ או לבודד שימוש, ותנאים של גידול הצמחים.
entomopathogens פטרייתיים הם רגולטורים חשובים של אוכלוסיות חרקים בעלי פוטנציאל רב כמו 1 mycopesticides. רק לאחרונה, עם זאת, יש לי entomopathogens פטרייתיים הוכח להתרחש כendophytes, הוא באופן טבעי ובתגובה לשיטות חיסון שונות 2. התפקוד האקולוגי של entomopathogens פטרייתיים endophytic נותר במידה רבה בלתי ידוע, אך מספר מחקרים מעורבים אותם בגידול צמחים 3,4, התנגדות אוכלי עשב 5-8, ועמידות למחלות 9,10. המטרה הכוללת של השיטות שהוצגו כאן היא להציג entomopathogen פטרייתי כendophyte, כהכנה להערכות עתידיות של דברה ביולוגית endophytic.
Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) הוא entomopathogen ביותר למד endophytic פטרייתי 5-9,11-19, והוא זמין כmycopesticide מסחרי. שיטות חיסון נבדקו כדי להקים <eמ '> ב' bassiana כendophyte כולל מספיג אדמת 14,17, ציפוי זרעים 18 והתעמקות 14, תחבושות radicle 13,15, שורש וקנה שורש התעמקות 11,16,18, גזע 17 זריקות, תרסיסי foliar 14,17,20 ותרסיסי פרחי 19. שימוש בשיטות אלה, חוקרים הציגו ב bassiana ל11 בננה, 7 שעועית, 13 קקאו, קפה 17, תירס 7, 7 כותנה, תמרים 12, יוטה 21, פרג אופיום 20, דלעת 7, radiata 18 אורן, סורגום 14, 7 ו 7 עגבניות חיטה. הראיות האחרונות עולות כי ב endophytic bassiana יש פוטנציאל להגן על צמחים מפני מזיקים לא רק חרקים 5-7,22-27, אלא גם מכמה פתוגנים צמח 9.
השעועית מצויה (Phaseolus vulgaris) מדרגת בין גידולים לפגיעים ביותר למזיקיםומחלות. זה יכול להיות מושפע על ידי יותר מ 400 מזיקים ופתוגנים 200, התקפה שנחשב לגורם ייצור השעועית המגבילה ביותר על פני 28 אזורים. בהתאם לכך, השעועית המשותפת עשויה להיות יבול מודל מצוין לבחון את מלוא הספקטרום של הדברה ביולוגית endophytic ידי B. bassiana. כצעד ראשון בכיוון זה, מאמר זה מתאר תרסיסי foliar ומתיז על קרקע כשיטות חיסון להציג B.bassiana כendophyte בשעועית המשותפת.
גורמים רבים יכולים להשפיע על התוצאה הספציפית של ניסוי להקמת entomopathogen פטרייתי כendophyte. התוצאות שלנו מראות את שיטת החיסון היא אחד מהם. גורמים ביולוגיים לניסוי עם כוללים מיני גידולים או זנים שנבחרו ומתח המינים entomopathogen פטרייתי או לבודד שימוש. גורמים נוספים לשקול מניפולציה כוללים ריכוז של הבידוד, גיל הצמח בחיסונים, ותנאים של גידול הצמחים.
זה יהיה אידיאלי לשיטת חיסון להביא לקולוניזציה צמח המערכתית ידי 14,17,18,21 entomopathogen פטרייתי. במקום זאת, נראה כי שיטות חיסון נוטות לטובת דפוס מסוים של התישבות מקומית. בקפה, למשל, תרסיסי foliar להעדיף התישבות עלה בעוד מספיג אדמה להעדיף התישבות שורש 17. אנחנו מצאנו אותו הדפוס בשעועית המשותפת. סופו של דבר, הבחירה של שיטת חיסון צריכה להיותמונחה על ידי המיקום המיועד של endophyte בתוך מפעל, ככל הנראה התאמת הנישה של אוכלי עשב היעד או פתוגן צמח.
למרות זיהוי נפוץ, endophyte וכימות מבוסס על תרבויות תקשורת יכולים להיות יקר, קשים ונוטים שגיאות. לדוגמה, בסך של 10,800 חלקי צמח (מצופה על צלחות פטר 1800) הוערך בניסוי כדי לייעל B. חיסוני bassiana על 16 בננות. מתוך אלה, 4496 סעיפים היו קולוניה ב משוער bassiana, כפי שזוהה בעיקר על ידי מורפולוגיה מושבה. ברור, אימות מיקרוסקופית של המין אנושי לכל מושבה הייתה צעד רצוי אך להרשות לעצמה. מצד השני, 1176 סעיפים היו מיושבים על ידי פטריות אחרות ונזרקו ומטופל כחסרי נתונים 16. ההסתברות קיימת, עם זאת, כי ב ' bassiana היה מתחרה גרוע או איטי לגדול, וסופו של דבר היה יכול להופיע מסעיפים אלה, אםמספיק זמן llowed. לכן, שיטות זיהוי endophyte מבוססות על תרבויות תקשורת כפופות לתוצאות חיוביות שגויות ושליליים שווא. בהתאם לכך, הפיתוח של זיהוי אמין יותר ושיטות כימות, למשל אלה המבוססים על תגובת שרשרת פולימרז (PCR) מבחנים 20,21,24, מוצדק היטב.
המטרה הסופית של ניסויי חיסון צריכה להיות כדי לפתח טיפול יעיל המספק התנגדות מערכתית עמידה נגד תזונה צמחונית ו / או מחלה. סביר, אבל עדיין לא נבדק, השערה היא כי היקף התישבות endophytic צריך מיתאם חיובי עם המידה של התנגדות endophyte בתיווך. צעד טבעי הבא לאחר זיקוק שיטות חיסון, ולכן, יכול להיות לבחינת המתאם הזה. כמה פרוטוקולי וידאו יכולים לעזור לחוקרים לתכנן assay התנגדות מתאימה למזיקי יעד או פתוגן 29-31. סופו של דבר, היא זו בדיקה שתקבע את ההצלחה של inoculaשיטת tion, והפוטנציאל הקשורים לבקרה ביולוגית endophytic.
The authors have nothing to disclose.
הייצור והעבודה הניסויית שהוצגו במסמך זה משקפים את עזרתו המסורה והנלהבת של רינאלדו Pareja. ממומן על ידי המחלקה המנהלית של קולומביה למדע, הטכנולוגיה והחדשנות (Colciencias) ועל ידי מענק מקרן ביל ומלינדה גייטס ביוזמת חקירות האתגרים הגדולה.
REAGENTS | |||
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
Mycotrol SE | Laverlam | 4167 | |
Noble agar | Sigma | A5431-250G | |
Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-25MU | |
Petri dish (100 x 15 mm) | Fisher | 08-757-12 | |
Petri dish (60 x 15 mm) | Fisher | 08-757-13A | |
Potato dextrose agar | Difco | 213400 | |
Regular bleach (NaOCl) | CLOROX | N/A | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Tetracycline | Sigma | T3258-25G | |
Triple quince (NPK) | ABOCOL | N/A | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
EQUIPMENT | |||
Biological safety cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Leica DM LB microscope | Leica | N/A |