Photothrombotic Iskæmi: en minimalt invasiv og reproducerbar Fotokemisk Cortical Lesion Model for Mus Stroke Studies

Summary

Photothrombosis er en hurtig, minimalt invasiv teknik til at inducere små og velafgrænset infarkt i områder af interesse på meget reproducerbar måde. Det er især velegnet til at studere cellulære og molekylære reaktioner underliggende hjernens plasticitet i transgene mus.

Abstract

Den photothrombotic slagtilfælde model til formål at inducere en iskæmisk skade inden for et givet kortikal område ved hjælp af foto-aktivering af en tidligere injiceret lysfølsom farvestof. Efter belysning, er farvestoffet aktiveres og producerer singlet oxygen, der skader komponenter af endotheliale cellemembraner, med efterfølgende blodpladeaggregering og thromber dannelse, som i sidste ende bestemmer afbrydelse af lokal blodgennemstrømning. Denne tilgang, som oprindeligt foreslået af Rosenblum og El-Sabban i 1977, blev senere forbedret ved Watson i 1985 i rottehjerne og lægge grundlaget for den nuværende model. Også den øgede tilgængelighed af transgene mus linjer bidrog yderligere til at hæve renten på photothrombosis modellen. Kort fortalt er et lysfølsomt farvestof (Rose Bengal) injiceret intraperitonealt og ind i blodbanen. Når det belyses med en kold lyskilde, farvestoffet bliver aktiveret og inducerer endotelødelæggelse med blodpladeaktivering og trombose, hvilket resulterer i lokalblodgennemstrømning afbrydelse. Lyskilden kan påføres på den intakte kraniet uden behov for kraniotomi, som tillader målretning af enhver kortikale område af interesse i en reproducerbar og ikke-invasiv måde. Musen er sutureres derefter og får lov til at vågne op. Evalueringen af ​​iskæmisk skade kan hurtigt opnås ved triphenyl-tetrazoliumchlorid eller cresylviolet farvning. Denne teknik producerer infarkt af lille størrelse og godt afgrænsede grænser, hvilket er yderst fordelagtigt for præcis celle karakterisering eller funktionelle studier. Endvidere er det særligt velegnet til at studere cellulære og molekylære reaktioner underliggende hjernens plasticitet i transgene mus.

Introduction

I begyndelsen af det 21. århundrede, er iskæmisk slagtilfælde en ødelæggende lidelse, der repræsenterer den anden årsag til langsigtet handicap ¹ og den anden årsag til dødelighed på verdensplan, hvor slagtilfælde tegnede sig for ca 5,7 millioner dødsfald i 2004 ^2. På trods af de mange bestræbelser, der blev sat ind, er der stadig ingen effektiv behandling til rådighed til at forbedre funktionelle opsving efter slagtilfælde. Dyremodeller for slagtilfælde er meget udbredt inden for slagtilfælde forskning som de tillader modellering af patofysiologien af iskæmisk skade og teste effektiviteten af forskellige neuroprotektive strategier in vivo. De fleste af disse modeller har til formål at fremkalde omfattende infarkter ved at afbryde (midlertidigt eller permanent) blodgennemstrømningen i midten cerebral arterie, mens andre modeller blev udviklet for at studere læsioner af lille størrelse i bestemte områder, typisk motor og somatosensoriske cortex. Imidlertid kan adskillige faktorer bidrager til at generere acertain grad af variabilitet i eksperimentelle slagtilfælde undersøgelser, herunder mus anvendte stamme, alder og køn af dyr indgår i undersøgelsen, og frem for alt den teknik vedtaget at inducere iskæmisk skade. Med hensyn til det sidste punkt, varigheden og invasiv kirurgi (dvs. behovet for en kraniotomi) samt den kirurgiske færdigheder, der kræves til operatøren pålideligt inducere en iskæmisk læsion er kritiske determinanter for en vellykket og objektiv in vivo slagtilfælde undersøgelse .

Begrebet photothrombosis blev oprindeligt foreslået af Rosenblum og El-Sabban i 1977 ³ og blev berømt ved sin ansøgning rottehjernen af Watson et al i 1985 ^4, hvor teknikken blev meget bedre, og lægge grundlaget for den nuværende model ^{3.. – 6..} Den photothrombotic fremgangsmåde har til formål at fremkalde en kortikale infarkt gennem foto-aktivering af en lysfølsom farvestof tidligere leveret til blod-system, whICH resulterer i lokal fartøj trombose i de områder, der udsættes for lys. Når den cirkulerende farvestof belyst den passende bølgelængde ved en kold lyskilde, frigiver energi til ilt molekyler, som igen genererer en stor mængde meget reaktive singlet oxygen produkter. Disse oxygenmellemprodukter inducerer endotelcelle membran peroxidation, hvilket fører til blodpladeadhæsion og aggregering, og til sidst til dannelsen af tromber som bestemmer lokal cerebral flow afbrydelse ^7..

Photothrombosis er en ikke-kanonisk iskæmisk model, der ikke tilstoppe eller bryde kun én arterie, som det normalt sker i menneskelig slagtilfælde, men inducerer læsioner i mere overfladiske blodkar, hvilket resulterer i selektiv afbrydelse af blodgennemstrømningen i de områder, der udsættes for lys. Af denne grund kan denne fremgangsmåde være egnet til cellulære og molekylære studier af kortikal plasticitet. Den væsentligste fordel ved denne teknik ligger i dets enkelhed udførelse.Desuden kan photothrombosis let udføres i cirka 40 minutter per dyr, herunder tyve minutters ventetid (3 min til anæstesi, 1 min at barbere hovedbunden, 3 til 5 min at placere dyret på stereotaxic apparat; 2 min til at skrubbe hovedbunden med antiseptisk opløsning, lave et snit og rengør kraniet, 2 til 4 minutter at placere koldt lys fiber, 1 min til at injicere Rose Bengal opløsning; 5 min-vent til intraperitoneal udbredelsen 15 min af belysning og 5 min til rense såret og sutur dyret). Desuden er der ikke kirurgisk ekspertise til at udføre denne teknik som læsionen er induceret ved hjælp af enkle belysning af den intakte kraniet. I modsætning til klassiske tillukning af blodkar, afgør denne metode selektive tillukning af pial og intraparenchymal mikrokar inden den bestrålede zone og reducerer mangfoldigheden af ​​læsioner, som ingen sikkerhedsstillelse fartøj er overladt til at levere ilt i målområde.

På trods af sin særlige karakter, atphotothrombotic skader aktier væsentlige mekanismer forekommer i hjernen slagtilfælde. Ligeledes til arterieokklusion i human slagtilfælde, blodpladeaggregering og koageldannelse bestemme afbrydelse af blodgennemstrømningen i det bestrålede område ^7.. Ligeledes denne model deler også vigtige inflammatoriske reaktioner som i midten cerebral arterieokklusion ^8.. Men på grund af de godt afgrænses grænser er det penumbral zone, hvilket svarer til et areal på delvist bevaret stofskifte, meget reduceret eller ikke-eksisterende efter en photothrombotic læsion. Denne klare grænse kan lette undersøgelsen af ​​cellulære responser inden iskæmisk eller intakt kortikale område. Photothrombosis musemodel er særligt egnet til slagtilfælde undersøgelser i en række forskellige transgene dyr. Faktisk klassiske modeller kan ikke passe til alle stammer og lange periode undersøgelser i C57BL / 6 musestamme rapporteret en høj dødelighed ratio, der kan forårsage skævhed ^9..

Protocol

1.. Pre-operation Afvejes Rose Bengal i et 1,5 ml rør og opløses i steril saltvandsopløsning, indtil den når en endelig koncentration på 15 mg / ml. Filtersteriliser gennem et 0,2 um filter og opbevar den i mørke ved stuetemperatur i op til to måneder. Sterilisere alle kirurgiske instrumenter ved autoklavering. Den kirurgiske område bør desinficeres mindre end en time før initiering af operationen. Optag musen kropsvægt for at justere dosis af Rose Bengal skal injiceres. Vi inji…

Representative Results

Denne protokol vil producere en cortical læsion, er allerede synlige ved dissektion af cortex med det blotte øje (figur 1A-1C). Den photothrombotic læsion udvikler sig i overfladiske og dybe kortikale lag, hvor vævet er tilstrækkelig gennemsigtigt til at tillade foto-aktivering af Rose Bengal. Måling af omfanget af cerebral infarkt kan udføres hurtigt ved histologisk farvning med triphenyl-tetrazoliumchlorid (TTC) på frisk væv eller ved cresylviolet efter fiksering i 4% paraformaldehyd (PFA). F…

Discussion

Modifikationer og substitutioner

På grund af sin absorptionstop ved 562 nm, blev et grønt laserlys fra en filtreret xenon bue lampe oprindeligt valgte at bestråle det lysfølsomme Rose Bengal. Selvom laser-medieret excitation stadig blev brugt recently5, kan det blive erstattet af koldt lys lampe, der også sikre farvestof excitation ^10,15. Koldt lys optiske fibre er lettere at manipulere og billigere end laserkilder. Imidlertid bør det bemærkes, at lasere er almindeligt anvendt…

Materials

MATERIAL NAME	COMPANY	CATALOGUE NUMBER
			Solutions and chemicals
Rose Bengal	Sigma, Italy	330000
Isoflurane Vet	Merial	103120022
Betadine	Asta Medica
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
			Surgical material and equipment
Fluosorber Filter	Havard apparatus	340415
150W fiber optic illuminator	Photonic	PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF	Havard apparatus	727561
Stereotaxic Instrument	Stoelting	51950
Operating microscope	Takagi	OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools	World precision instrument		Optic fiber taps and mask are custom-made