בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em> Thaliana ארבידופסיס</em> זרעים
Summary
אנו מדווחים שיטה יעילה ופשוטה לבודד את העוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח מ<em> Thaliana ארבידופסיס</em> זרעים. יכולים להיות מבודדים עד 40 עוברים בשעות 1 עד 4 שעות, תלוי ביישום במורד הזרם. ההליך מתאים לtranscriptome, מתילציה DNA, ביטוי עיתונאי גן, immunostaining וקרינה<em> באתר</em> ניתוחי הכלאה.
Abstract
בצמחים פורחים, העובר מתפתח בתוך רקמה מזינה – האנדוספרם – מוקפת נעשה עור הזרעים האימהי (או מעיל זרע). כתוצאה מכך, את הבידוד של עוברי צמחים בשלבים מוקדמים (שלב 1 עד תא כדורי) הוא מבחינה טכנית מאתגר בשל הנגישות היחסית שלהם. נתיחת שימוש יעילה בשלבים מוקדמים הנו פגומה מאוד על ידי הגודל הקטן של זרעי ארבידופסיס צעירים והדביקות של העובר לרקמות שמסביב. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת בידוד יעיל של עוברי ארבידופסיס צעירים, מניב עד 40 עוברים בשעות 1 עד 4 שעות, תלוי ביישום במורד הזרם. עוברים משתחררים לחיץ בידוד על ידי ריסוק מעט 250-750 זרעים עם העלי פלסטיק בצינור Eppendorf. זכוכית microcapillary קשורה הוא למעבדת פיפטה סטנדרטית (דרך צינור גומי) או microinjector נשלט הידראולי משמש כדי לאסוף עובר ממקום טיפותד בשקופית רב גם במיקרוסקופ אור הפוכה. את הכישורים הטכניים הנדרשים הם פשוט והעברה בקלות, וההתקנה הבסיסית אינה דורשת ציוד יקר. עוברים שנאספו מתאימים למגוון רחב של יישומים במורד הזרם, כגון מבחני גן כתב RT-PCR, RNA רצף, ניתוחי מתילציה DNA, הקרינה הכלאה באתרו (FISH), immunostaining, ו.
Introduction
העובר של צמחים פורחים מוקף האנדוספרם, רקמה תזונתית הנגזרת מאירוע הפריה שנייה. גם העובר והאנדוספרם מוקפים בכמה שכבות תאים של קליפת הזרע. ביחד רקמות אלה יוצרים זרעים, אשר יפתחו בתוך הפרי. לפיכך, רקמות וניתוחים ספציפיים של תאי עוברי ארבידופסיס לקויים בשל חוסר הנגישות שלהם בחום. עם זאת, עובר בשלבים מאוחר הכדוריים או במאוחר הם טוב יחסית נוחים לנתיחה ידנית על ידי שימוש במחטים עדינות תחת טונגסטן סטראו, או על ידי הפעלת לחץ קל על הזרע באמצעות מלקחיים כדי לחלץ אותם. טכניקות כאלה היו בשימוש בהצלחה לtranscriptome או ניתוחי אפיון epigenome כמו הכלאה microarray, רצף bisulfite, או RNA רצף (לדוגמה, 1-3). לעומת זאת, המחקרים של עוברים בשלב הזיגוטה לכדורי מוקדם יישארו מאתגרים מבחינה טכנית. נכון להיום, רק כמה מחקרים יש נציגניתוחי transcriptome orted על עוברים צעירים או באמצעות microdissection לייזר לכידה (LCM) של רקמות עוברי מסעיפי זרעים קבועים 4 או מיצוי ידני של עוברים נפרדים מתוך זרעים באמצעות כלים עדינים 5. עם זאת, ציוד LCM אינו זמין בדרך כלל והפקת מדריך לעובר בשלבים מוקדמים הוא זמן רב ודורשים מיומנויות נתיחה מצוינות כי הם לא בקלות להעברה. בנוסף לניתוחי הגנום כולו, בניתוח ביטוי גנים באתרו הם גם קשה לביצוע בעוברים של ארבידופסיס צעירים, כל ההר. במידה מסוימת, ניתן לשחרר עוברים צעירים על שקופיות מיקרוסקופ על ידי לחץ עדין על הזרעים ומשמשים למבחני גן כתב או זיהוי חלבון על ידי immunostaining (לדוגמה ראה 6,7). טכניקה זו, עם זאת, אינה מאפשרת בידוד עובר תפוקה גבוהה, ובכך פוגע בניתוחים כמותיים.
לכן, פיתחנו פרוטוקול יעיל ומהירלבידוד עובר מוקדם מזרעי ארבידופסיס כי הוא פשוט להתקנה, להעברה בקלות, ומתאים למגוון רחב של יישומים במורד הזרם. העיקרון הבסיסי הוא לרסק את הזרעים בעדינות – גזור מsiliques צעיר בצינור Eppendorf באמצעות העלי פלסטיק בחיץ בידוד מתאים. תמצית הזרעים ממוקמת בטיפין בשקופית רב גם, והוא הוקרן בנוכחותם של עוברים שפורסמו בשלב הרצוי באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. עוברים נאספים באמצעות זכוכית microcapillary המצורפת microinjector או פיפטה מעבדה סטנדרטית. עבור יישומים מולקולריים, עוברים נשטפים פעמיים על ידי שחרורו חזר לטיפין של חיץ בידוד חדש לפני העברתם למאגר שהיעד בנפח מינימאלי. עבור יישומי ציטולוגיה (מבחני כתב, immunostaining, דגים), ניתן להשמיט שלבי כביסה.
השיטה מציעה מספר יתרונות: (i) זה מניב 25-40 עוברים ב~ 45 דקות לאפליקצית ציטולוגיהlications או בשעות 3-4 עבור יישומים מולקולריים (כולל שלבי הכביסה), (ב) שהוא מאפשר בידוד של שלבים עובריים ספציפיים, (iii) הוא בקלות להעברה לאנשים אחרים ומעבדות עקב ההתקנה הפשוטה שלה, (ד) אותה דורש ציוד במחיר סביר עבור ההתקנה הבסיסית, הניתנת לשדרוג, ו( V) זה היה בשימוש בהצלחה ליישומים שונים במורד הזרם, כגון RNA רצף 8, גן ספציפי ניתוח ה-DNA מתילציה 9, מבחני כתב (10 וRaissig et al., בהכנה.), ודגים (ג'Jaenisch, ע Grossniklaus, ג Baroux לא פורסם, ראו איור 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתחנו פרוטוקול בידוד עובר שהוא מהיר, יעיל, וניתן להעביר בקלות למעבדות אחרות.
הציוד המתואר כאן מורכב ממיקרוסקופ ההפוך, micromanipulator, זכוכית microcapillaries, חולץ נימה אנכי וmicroinjector (איור 3 א). ההתקנה דומה לזה שתואר לבידוד תא בעלי חיי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לטל Nawy ומרטין באייר לעצתם בבידוד עובר. MTR, VG, UG וCB פיתחו ציוד בידוד העובר. MTR, VG ו CB פיתחה פרוטוקול בידוד העובר. MTR, VG ו CB הקים את הפרוטוקול, בודד את העוברים, ועובר שנוצר cDNA, VG ביצע PCR, MTR מכתים גאס, ג'יי ג'יי ניסויי הדגים. MTR, VG, CG וUG כתבו את כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי אוניברסיטת ציריך, אחוות קרן מחקר רוש (לMTR), ומענקים מהקרן הלאומית שוויצרי (לUG וCB).
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies |
References
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), (1111).
