から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離<em>シロイヌナズナ</em>種子
Summary
我々は、より開発の初期段階で胚を単離するための効率的で簡単な方法を報告する<em>シロイヌナズナ</em>種。最大40胚には、下流のアプリケーションに応じて、1時間〜4時間で単離することができる。手順は、DNAのメチル化は、レポーター遺伝子の発現、および免疫蛍光トランスクリプトームのために適している<em>その場で</em>ハイブリダイゼーション分析。
Abstract
胚乳 – – 母親の種子の外皮（または種皮）に囲まれた顕花植物では、胚は栄養組織内で開発しています。その結果、初期段階（球状ステージに1セル）での植物の胚の分離が技術的にそれらの相対的な到達不能のために挑戦している。早い段階での効率的な手動の郭清が強く若いシロイヌナズナ種子のサイズが小さく、周囲の組織への胚の接着性によって損なわれている。ここでは、下流のアプリケーションに応じて、1時間〜4時間で40胚まで降伏、若いシロイヌナズナ胚の効率的な分離を可能にする方法について説明します。胚はわずかにエッペンドルフチューブ内でプラスチック乳棒で250から750種を粉砕することにより単離緩衝液中に放出される。ガラスピペット（ゴムチューブを介して）または油圧制御マイクロインジェクターを滴場所から胚を収集するために使用される標準的な実験室のどちらかに接続されているマイクロキャピラリー倒立光学顕微鏡にマルチウェルスライド上のD。必要な技術的なスキルは、シンプルかつ簡単に譲渡され、基本的なセットアップは、高価な機器を必要としません。収集された胚は、例えばRT-PCR、RNA配列決定、DNAメチル化分析、in situハイブリダイゼーション（FISH） の蛍光、免疫染色、およびレポーター遺伝子アッセイなどの下流の種々の用途に適している。
Introduction
顕花植物の胚は胚乳、第二の受精イベントから派生した栄養組織に囲まれています。胚と胚乳の両方が種皮のいくつかの細胞層に囲まれています。総称して、これらの組織は、果実内部で開発する種子を形成。このように、組織及びシロイヌナズナ胚の細胞特異的な分析が強く、その到達不能が損なわれている。それにもかかわらず、後期球状以降の段階で胚は比較的よく実体顕微鏡下に細いタングステン針を使用して手動で切開の影響を受けやすい、またはそれらを抽出するために鉗子を使用して種子にわずかな圧力を加えることによってです。このような技術は、正常トランスクリプトームまたはそのようなマイクロアレイハイブリダイゼーション、バイサルファイトシークエンシング、又はRNA配列決定（ 例えば 1-3）としてエピゲノムプロファイリング解析に用いた。これとは対照的に、初期の球状ステージへの受精卵における胚の研究は技術的に困難なままです。現在までに、唯一のいくつかの研究では、担当者が持っている固定シードセクション4ま たは罰金ツール5を使用して、種子の中から個々の胚の手動抽出から胚組織のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）のいずれかを使用して若い胚でortedトランスクリプトーム解析。しかし、LCM装置は早い段階で一般的に利用可能と手動胚抽出ではないことは、時間が容易譲渡することはできません優れた解剖のスキルを消費して必要である。ゲノムワイドな解析に加えて、 その場遺伝子発現解析は、 シロイヌナズナの若者、ホールマウント胚で実行することも困難である。ある程度まで、若い胚は種子穏やかな圧力によって顕微鏡スライド上に解放することができ、（例えば6,7を参照）免疫染色によりレポーター遺伝子アッセイまたはタンパク質検出に使用される。この技術は、しかしながら、このようにして定量分析を妨げ、高スループット胚を分離することはできません。
したがって、我々は、効率的かつ迅速なプロトコルを開発した、簡単に譲渡、下流の様々なアプリケーションに適した設定が簡単であるシロイヌナズナ種子から初期胚の分離のために。適切な分離バッファにプラスチック乳棒を用いてエッペンドルフチューブの若い長角果から解剖 – 基本的な原理は、優しく、種子を粉砕することです。種子抽出物は、マルチウェルスライド上に液滴内に配置され、倒立顕微鏡を用いて所望の段階で放出胚の存在についてスクリーニングする。胚をマイクロインジェクターまたは標準的な実験室ピペットに装着マイクロキャピラリーガラスを使用して収集されます。分子のアプリケーションでは、胚は最小限のボリュームで宛先バッファに転送する前に、新しい分離バッファの滴に繰り返さリリースで2回洗浄する。細胞学的アプリケーション（レポーターアッセイ、免疫染色、FISH）、洗濯手順については省略することができます。
方法はいくつかの利点を提供します：（i）は、それは細胞学的アプリケーションのための〜45分で25-40の胚が得られlicationsまたは分子アプリケーション用の3-4時間で（洗浄ステップを含む）、（ⅱ）、特定胚の段階の分離を可能にし、（ⅲ）それは、その簡単なセットアップのために他の人や研究室へ簡単に譲渡され、（ⅳ）、それはアップグレードに従順である基本的なセットアップのための手頃な価格の機器が必要であり、および（v）それは正常なRNAシーケン8、遺伝子特異的なDNAメチル化分析9、レポーターアッセイ（10 Raissig らなど、様々なダウンストリームアプリケーションに使用されました）。準備、およびFISH（J.イェーニッシュ、U. Grossniklaus、未発表C. Baroux、 図5を参照）。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、効果的な、迅速で胚分離プロトコルを開発し、容易に他の研究所に転送することができる。
ここで説明する機器は、倒立顕微鏡、マイクロマニピュレータ、ガラスマイクロキャピラリー、縦フィラメントプラーとマイクロインジェクター（ 図3A）で構成されています。セットアップは、トランスクリプトミクス解析17のための単一の動物細?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、胚の分離の彼らのアドバイスをタルNawyとマーティンバイエルに感謝したいと思います。 MTR、VG、UGおよびCBは、胚分離装置を考案した。 MTR、VGとCBが胚分離プロトコルを開発しました。 MTR、VGとCBは、プロトコルを確立し胚を単離し、胚cDNAを生成し、VGは、PCR、MTR GUS染色、JJ FISH実験を行った。 MTR、VG、CGとUGは、原稿を書いた。この作品は、チューリッヒ大学、ロシュ研究財団（MTR）に旅の仲間、そしてスイスの建国（UGとCBへ）からの補助金によって賄われていた。
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies |
References
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