כמותיים Multispectral ניתוח בעקבות השתלת רקמות פלורסנט וליזואליזציה של מקורות ניידים, סוגים, ואינטראקציות

Summary

המוני רקמות מורכבים, מאיברים לגידולים, מורכבים מאלמנטים הסלולר שונים. אנו הובהר התרומה של פנוטיפים הסלולר בתוך רקמת ניצול עכברים הטרנסגניים ניאון רב שכותרתו בשילוב עם מכתים immunofluorescent multiparameter אחרי unmixing רפאים לפענח מוצא תא, כמו גם מאפייני תא המבוססים על ביטוי חלבון.

Abstract

עם הרצון להבין את תרומתם של מרכיבים תאיים רבים להתפתחות של רקמות מורכבות, כגון סוגי תאים רבים המשתתפים בהתחדשות רקמות, היווצרות גידול, או vasculogenesis, אנחנו המצאתי מודל השתלה סלולרית צבעונית של התפתחות גידול ב שאוכלוסיות תאים שמקורם מעכברים שונים fluorescently צבע כתב גן והם מושתלים, engrafted או מוזרק ובסביבת גידול מתפתחת. לאחר מכן תאים צבעוניים אלה גויסו ושולבו בstroma הגידול. על מנת להעריך כמותית תאי סטרומה מח עצם נגזרים גידול, אנו מושתלים GFP להביע מח עצם כולו מהונדס לתוך RFP קטלני מוקרן להביע עכברים כפי שאושר על ידי IACUC. גידולי 0ovarian שהוזרקו orthotopically לעכברים המושתלים היו נכרת לאחר 6-8 שבועות engraftment וניתחו עבור סמן מח עצם ממקור (GFP), כמו גם סמני נוגדנים לזהות גידול קשורstroma תוך שימוש בטכניקות הדמיה multispectral. לאחר מכן, אנו הותאמו המתודולוגיה שאנו מכנים MIMicc-Multispectral חקירה של יצירות סלולריות Multiplexed, באמצעות unmixing multispectral של fluoroprobes להעריך כמותית שכותרתו התא בא ממנה האוכלוסיות מתחילות (המבוססות על תוויות גן כתב מקוריות), וכמו היכולת שלנו unmix 4, 5 , 6 או יותר ספקטרום לעליות שקופיות, הוספנו אימונוהיסטוכימיה נוספת הקשורות לשושלות תאים או בידול כדי להגדיל את הדיוק. ניצול תוכנה כדי לזהות אותות מרובבים-ניאון מקומי משותף, ניתן לייחס אוכלוסיות סטרומה גידול, מנויות ומאופיינות מבוססות על כתמי סמן. ¹

Introduction

הבנת התפתחות ותיקון רקמות היא משמעותית להבהרת מרכיבים תאיים משתתפים בריפוי פצעים, ^2,3 רפואת רגנרטיבית, ביולוגיה התפתחותית וביולוגיה של גידול. בנסיבות של תיקון, סוגים רבים של תאים לחדור microenvironment שמסביב כדי לסייע בכלי דם, בתצהיר ECM, שגשוג ובנייה מחדש של רקמות. ניתן לזהות גורמים ופנוטיפים סלולריים המבוססים על פרמטרים מרובים, סמנים מרובבים שיכול לזהות את הלוקליזציה, מצב בידול ויחסי גומלין בין מרכיבים תאיים בתוך microenvironment נחקר. במסמך זה, אנו מתארים את התפתחות גידול כדוגמא טיפוסית למודל השתלה זו ססגוניות-תאית ואחרי ההדמיה multispectral ומתודולוגיה unmixing רפאים.

התקדמות גידול היא תהליך רב שלבי שהתאפיין במספר יכולות שנרכשו הכוללות משופרת התפשטות,מאפייני ntiapoptotic, פולשנית ואנגיוגנזה. התפתחות גידול ⁴ הוא הקלה על ידי תאים שאינם neoplastic כי הם גויסו לסביבה כדי לספק גורמי גדילה, מטריצות מבניות, רשתות כלי דם ואפנון חיסוניים. ^1,5,6 microhabitat זה מורכב מהתאים שמקורם רקמות מקומיות, שכנות כמו שומן, וכלי דם ומקורות רחוקים, כמו תאים שמקורם במח עצם ^1. התאגדות מסוג התאים לא neoplastic מידת ההשפעה תלויה בביקוש מהגידול, אשר לעתים קרובות תואם את השלב / הכיתה של הגידול. כדי להבין את תפקידו של המיקרו תומך הגידול, יש להבין את מקורו ואת פוטנציאל ההתמיינות של אוכלוסיות תאים שאינם neoplastic.

פרוטוקול זה תוכנן כדי לסייע בפרשנות של התקדמות גידול באמצעות ההדמיה של שני מרכיבים התאיים שמקורם במח העצם, וderiv הרקמות המקומיתed תאים. ניצול עכברים להביע גן כתב ניאון מהונדסים, אנחנו מושתלים GFP מח עצם (חלבון ירוק ניאון) לRFP קטלני מוקרן עכבר (חלבון אדום ניאון). בעקבות קליטתם מח עצם מוצלחת, שורת תאים הסרטני syngeneic מוזרקת orthotopically ואפשרה לנקלטת ל4-8 שבועות. הגידול וכתוצאה מכך הוא נכרת מהעכבר ומעובד לimmunofluorescent (IF) מכתים לדמיין את רכיבי סטרומה. ריבוב אם סמנים הוא טכניקה הנפוצה שכרוכה באופטימיזציה משמעותית ^7-9, זאת תוך שימוש בפלטפורמת ההדמיה / unmixing multispectral משפר את הפוטנציאל לשילובי סמן פלואורסצנטי שיש להם חפיפה ספקטרלית. במסמך זה אנו מציגים טכניקה שאנחנו מכנים חקירת MIMicc-multispectral של יצירות סלולריות Multiplexed להכתים ולנתח עד שמונה סמנים בתוך קטע גידול בשקופית אחת על מנת לנתח את המקורות התאיים, התמיינות תאית status ותאי תאי אינטראקציות של רכיבים בתוך microenvironment הגידול. יש דוגמא פשוטה זו יש הפוטנציאל להיות מורחב על מנת לנתח חמש, שש, או יותר סמני ניצול נוגדנים או ביטוי תאיים מונע אמרגן ניאון. לוח רשימות 1 שילובי מכתים נוגדן ניאון פוטנציאליים עם מינים מתאימים נלקחו בחשבון.

Protocol

Syngeneic Murine להשתלת מח עצם (BMT) כפי שאושרה על ידי פרוטוקולי IACUC מוסדיים (הערה: הצלחה של פרוטוקול זה דורשת ניצול מכל סוג שכותרתו תא (ים) כיעד לניתוח multispectral, וכדי להקל על הניתוח במורד הזרם, אפשר לנצל כל גנטית או תיוג סלולארי יציב. אנו מציעים כי כל תא, רקמה, או יכול להיו?…

Representative Results

שימוש בטכניקת הדמיה multispectral לנתח גידולי engrafted במודל העכבר המהונדס שלנו BMT, אנו מסוגלים להבחין במרכיבי גידול סטרומה שהם ממוצא מח עצם. BMT הראשוני אושר שלושה שבועות לאחר השתלה על ידי cytometry זרימה (איור 1). Orthotopically הזריק גידולי השחלות ללא תווית הבאה אישורי engraftment BMT ה…

Discussion

במסמך זה אנו מתארים את היישום של ההדמיה multispectral אנו מתארים כחקירת MIMicc-multispectral של יצירות סלולריות Multiplexed, לנתח את רכיבי סטרומה שמקורם במח העצם של microenvironment הגידול, לעומת זאת מתודולוגיה זו ורעיון יכולים להיות מיושמים לפענוח מרכיבים תאיים אחרים המרכיבים את מתחם רקמות כמו…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
			Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml