Isolering, bearbetning och analys av murina Gingival Cells
Summary
Denna studie beskriver en effektiv teknik för att isolera och behandla gingival vävnad från mus munhålan för att producera en enda cellkultur. De resulterande cellerna kan vidare användas för flödescytometrianalys och molekylära studier.
Abstract
Vi har utvecklat en teknik för att exakt isolera och bearbeta murina tandköttsvävnad för flödescytometri och molekylära studier. Tandköttet är en unik och viktig vävnad att studera immunmekanismer eftersom det är inblandat i värdens immunsvar mot oral biofilm som kan orsaka parodontala sjukdomar. Vidare möjliggör närhet av tandköttet till alveolär benvävnad studerar också benremodelleringen enligt inflammatoriska tillstånd. Vår metod ger stora mängder av immunceller som tillåter analys av även sällsynta cellpopulationer såsom Langerhans celler och T reglerande celler som vi visat tidigare 1. Anställa möss för att studera lokala immunsvar involverade i alveolarbenförlust under parodontala sjukdomar är fördelaktig på grund av tillgängligheten av olika immunologiska och experimentella verktyg. Ändå, på grund av sin ringa storlek och den relativt obekvämt tillgång till den murina gingiva, undvek många studier undersökning av This kritiska vävnad. Den metod som beskrivs i detta arbete skulle kunna underlätta gingival analys, vilket förhoppningsvis kommer att öka vår underskatta den muntliga immunförsvaret och dess roll under parodontala sjukdomar.
Introduction
Gingiva är den mjuka vävnaden som omger cervikala delen av tänderna och täcker den alveolära processen (figur 1). Tandköttet är en typ av tugg slemhinna som kan separeras ytterligare i mukosal epitel och bindväv (även känd som submukosa eller lamina propria). Den anatomiska strukturen av tandköttet och angränsande tänder gör att bakterier att bosätta sig och utveckla plack (biofilm) som ständigt utmanar det lokala immunförsvaret. Som ett resultat utvecklar inflammatoriska reaktionen i gingiva, vilket under vissa omständigheter blir destruktiv – ett tillstånd som kallas parodontala sjukdomar 2. I grund och botten, kan plack-inducerade parodontala sjukdomar delas in gingivit och parodontit. Gingivit representerar en reversibel tillstånd av lokala inflammatoriska responsen som är begränsad till gingiva. Periodontit, å andra sidan, är en irreversibel destruktiv process där fästanordningen (alveolärt ben, periodontalligament, cementum och tandkött) är förstörd 3.
Gingiva föreslogs att tjäna både som effektorceller och induktiva platser under parodontala sjukdomar 4. Mänskliga studier har föreslagit att som svar på dental plack, immuneffektorceller och molekyler dynamiskt infiltreras eller avgång tandköttet 5-7. Denna aktivitet visat sig spela en viktig roll i parodontal destruktion 8,9. De data som genereras av dessa studier som värdefull information om denna patologiska process, som arbetar med mänskliga vävnader besitter stora etiska, tekniska och experimentella begränsningar. Utvecklingen av experimentella modeller tillåtna orsak-verkan experimenterande via anställa transgena möss och in vivo interventioner 10. Som ett resultat, ökat vår kunskap om de mekanismer som är involverade i tandlossning avsevärt under de senaste två decennierna. Trots detta, på grund av komplexiteten av parodontala sjukdomar, finns deten pågående debatt om karaktären av det lokala immunförsvaret underlättar vävnadsdestruktion. Det finns också en brist i vår förståelse för funktionen av centrala immunceller i tandköttet under parodontala sjukdomar. Det är därför viktigt att studera patologiska inflammatoriska händelser som inträffar i målvävnaden av sjukdomen, tandköttet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Överkäke gingival vävnaderna från en enda mus är tillräckliga för att analysera undergrupper av T-och B-lymfocyter, liksom deras förmåga att uttrycka extracellulära och intracellulära molekyler som vi tidigare beskrivits 1. Men om sällsynta cellpopulationer är av intresse (t.ex. DC), rekommenderas att slå vävnader 2-3 möss. Notera, om föredraget, är det möjligt att skala både palatala och gingival vävnad och sedan till punktskattepliktiga tandköttet (en modifiering av steg 1,8-1,9). Det …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning har finansierats med bidrag från Israel Science Foundation (nr 1418-1411) till AHH och (nr 1933-1912) till AW, den tyska israeliska stiftelsen för unga forskare (GIF Young) till AHH, och Dr I . Cabakoff Research Donationsfond vid Hebrew University-Hadassah School of Dental Medicine till AHH och AW.
Materials
| Comments (optional) | Catalogue number | Company | Name of the reagent |
| CLS-2 | Worthington Biochemical Corp. | Collagenase Type II | |
| DN25-1G | SIGMA | DNAse I | |
| E6758-100G | SIGMA | EDTA | |
| D8537 | SIGMA | Dulbecco’s PBS | |
| Heat Inactivated | 04-121-1 | Biological Industries | Fetal Bovine Serum |
| FPE-204-500 | Jet Biofil | Vacuum-Driven Filter | |
| 352052 | BD Falcon | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | |
| 93070 | SPL Lifesciences | Cell Strainer 70 μm | |
| 153066 | NUNC | Tissue Culture Dish 35×10 mm | |
| 554714 | BD | BD Cytofix/Cytoperm | |
| Clone N418 | 117305 | Biolegend | Anti-mouse CD11c antibody |
| Clone 104 | 109819 | Biolegend | Anti-mouse CD45.2 antibody |
| Clone GK1.5 | 100413 | Biolegend | Anti-mouse CD4 antibody |
| Clone 53-6.7 | 100733 | Biolegend | Anti-mouse CD8a antibody |
| Clone 17A2 | 100214 | Biolegend | Anti-mouse CD3 antibody |
| Clone G8.8 | 118219 | Biolegend | Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody |
| Clone 929F3.01 | DDX0362D | Imgenex | Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody |
| Clone 39-10-8 | 115010 | Biolegend | Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody |
| BD Biosciences | LSR II Flow Cytometer | ||
| Tree Star | FlowJo Software v 7.6.5 |
References
- Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
- Listgarten, M. A. Pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).
- Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
- Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
- Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
- Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
- Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
- Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
- Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).
