Anwendung eines<em> In-vitro-</em> DNA-Schutz-Assay, um Stress Mediation Eigenschaften des DPS-Protein Visualisieren
Summary
Die DNA-bindendes Protein von ausgehungerten Zellen (DBS) spielt eine entscheidende Rolle bei der Bekämpfung bakterieller Belastung. Dieser Artikel beschreibt die Reinigung von<em> E. coli</em> Dps und das Protokoll für eine<em> In vitro</em> Test demonstriert DPS-vermittelte Schutz der DNA vor Abbau durch reaktive Sauerstoffspezies.
Abstract
Oxidativer Stress ist eine unvermeidbare Nebenerscheinung des aeroben Lebens. Molekularer Sauerstoff ist wichtig für terrestrische Stoffwechsel, aber es nimmt auch an vielen schädlichen Reaktionen im lebenden Organismen. Die Kombination von aeroben Stoffwechsels und Eisen, die eine weitere wichtige Verbindung für das Leben ist, ist genug, um Radikale durch Fenton Chemie produzieren und zelluläre Komponenten abbauen. DNA-Abbau ist wohl die schädlichen Prozess, der intrazellulären Radikale, wie DNA-Reparatur ist alles andere als trivial. Der Test in diesem Artikel vorgestellten bietet eine quantitative Methode zu messen und visualisieren die Wirkung von Molekülen und Enzymen auf radikalvermittelte DNA-Schäden.
Die DNA-Schutz-Assay ist eine einfache, schnelle und stabile Werkzeug zur in-vitro-Charakterisierung der schützenden Eigenschaften von Proteinen oder Chemikalien. Es schließt ein, dass eine DNA schädigende oxidative Reaktion und Zugabe von verschiedenen Konzentrationen der Verbindung von Interesse. Die Verringerung oder Erhöhung der DNA-Schädigung in Abhängigkeit von der Konzentration der Verbindung wird dann unter Verwendung von Gelelektrophorese sichtbar gemacht. In diesem Artikel zeigen wir die Technik der DNA-Schutz-Assay durch Messung der schützenden Eigenschaften der DNA-bindendes Protein von ausgehungerten Zellen (DBS). DPS ist eine Mini-Ferritin, das von mehr als 300 Bakterienarten verwendet wird, um kräftig zu bekämpfen Umwelt-Stressoren. Hier präsentieren wir die Dps Aufreinigungsprotokolls und die optimierten Testbedingungen für Auswertung DNA Schutz durch Dps.
Introduction
Aeroben Organismen müssen ständig mit reaktiven Sauerstoffspezies, die ihre DNA sowie andere wichtige biologische Makromoleküle beschädigen kämpfen. Ein starkes Werkzeug, um die toxischen Effekte von oxidativen Schäden entgegenzuwirken ist die DNA-bindendes Protein von ausgehungerten Zellen (DBS). Seit seiner Entdeckung im Jahre 1992 von ausgehungerten E. coli-Kultur 1 hat Dps in mehr als 300 Arten von Bakterien und Archaebakterien 2 identifiziert worden. Massiver Hochregulation von Dps während der stationären Phase macht es am meisten hochexprimierten nucleoid-assoziiertes Protein von E. coli unter Hunger Bedingungen 3, 4. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Dps sowohl bakterielle Lebensfähigkeit und DNA Integrität während vielen verschiedenen Belastungen, einschließlich Hunger, hohe Eisenkonzentration, UV-Licht Exposition, Hitzeschock, oxidativer Stress und 5, 6 zu bewahren.
Strukturell Dps Selbst-Mitarbeiter in eine stabile homooligomeren Komplex von 12 Monomere, werden in einem kugelförmigen hohlen Schale montieren. Das ~ 4,5 nm breiten inneren Hohlraum zugänglich an der Außenseite Lösungsmittel über Poren, die den Durchtritt von kleinen Molekülen 7 zu ermöglichen, und es kann mineralisierten Metallen wie Eisen 8 binden. Die schützende Wirkung von Dps leitet sich von seinen verschiedenen biochemischen Aktivitäten, die nicht-spezifische DNA-Bindung 1, Ferroxidaseaktivität und Speicherung von Eisen 8 gehören.
Detaillierte Studie der positiven biochemischen Aktivitäten von Dps erfordert zunächst seine Reinigung. Dps Reinigung ist eine aufwendige Prozedur, wie Dps nicht nur von anderen Proteinen getrennt werden müssen, sondern auch von jedem gebundenen DNA 7. Unsere optimierten Reinigungsprozess verwendet viele gängige Techniken, bestehend aus zwei Ionenaustausch-Säulen und einem Ammoniumsulfatfällung Schritt. Mehrere Puffer Börsen sind erforderlich, da hochkonzentriert Dps ausfallen können von Lösung in salzarme Bedingungen. Sobald Dps Protein wurde gereinigtKann es zu Assays, die direkt zu messen sein Ferroxidaseaktivität 8, DNA-Bindungsstöchiometrie 9 und Mechanismen Eisenbindungskapazität 10 aufgebracht werden. Gereinigt Dps hat auch andere Einsatzmöglichkeiten. Die stabile Hohlkugelstruktur von Dps als Gerüst wurde für die Speicherung von hydrophoben Teilchen im Inneren des Proteins Hohlraum 11 verwendet und sogar als eine Reaktionskammer zu synthetisieren neuartige magnetische Nanopartikel 12.
Die Schutzfähigkeit von Dps um Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies vermitteln kann klar und direkt nachgewiesen mit Hilfe der DNA-Schutz-Assay 13, 14. In diesem in vitro-Verfahren werden Radikale erzeugt, wenn Eisen katalysiert H 2 O 2 Zersetzung durch Fenton Chemie. Diese Reste direkt schädigen DNA in der Reaktion und vollständig abzubauen es bei hohen Konzentrationen. Zwei wichtige Dps Aktivitäten können sowohl direkt den Effekten entgegenzuwirken, von Fenton-vermittelten radikalischen Produktion. DPS senkt die Konzentration an katalytischem Eisen durch Mineralisierung und verbraucht den verfügbaren Wasserstoffperoxid in den Prozess. Darüber hinaus kann die Bindung an DNA DPS potentiell abschirmen physisch von Radikalen und kondensiert sie in ein kleineres Volumen mit weniger reaktiven Oberfläche. Die Kombination dieser beiden Eigenschaften macht den DNA-Schutz-Assay auch für den Zweck der Messung schützende Dps Aktivität geeignet.
Die DNA-Schutz-Assay ist sehr vielseitig und kann für eine Vielzahl von Anwendungen über DPS Charakterisierung verwendet werden. Radikale ist eine häufige Form von Stress in Zellen, und viele verschiedene Proteine und Chemikalien werden verwendet, um dem entgegenzuwirken. Das allgemeine Prinzip des Assays unter Verwendung von DNA-Integrität als Marker für Radikale, können in Kombination mit fast jedem Rest-produzierenden Reaktion oder entgegenwirkende Mittel eingesetzt werden. Unter anderem hat der Test erfolgreich verwendet, um anti-oxidativen Eigenschaften zu bestimmenvon K. paniculata Extrakt für den Einsatz in der Lebensmittelindustrie 15, um die Auswirkungen der Harnsäure auf Hydroxyl Schäden Mediation 16 charakterisieren und neue Einblicke in die Funktion des Fur Transkriptionsregulators Proteine 17 zu gewinnen.
Trotz der zahlreichen Verwendungen des Assay in veröffentlichten Arbeiten fanden wir, dass viele Optimierung und Fehlerbehebung erforderlichen Schritte wurden, wodurch die Einrichtung der Test zum ersten Mal eine unnötig aufwendige Arbeit für viele Forscher. Das Protokoll präsentieren wir in diesem Artikel soll diese Barriere für den Eintritt zu entfernen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Reinigungsverfahren Dps wie in diesem Artikel beschrieben wird, ist sehr robust. Reinheit ist durchweg hoch (> 99%); keine anderen Proteine scheinen auf SDS-PAGE-Gelen als sichtbare Banden. Trotzdem scheinen einige Chargen von gereinigtem DPS Nukleaseaktivität haben, wie durch partielle DNA-Abbau nachgewiesen, wenn mit sehr hohen Konzentrationen von Dps inkubiert. Dies könnte darauf hindeuten, das Vorhandensein von hochaktiven DNasen bei niedriger Konzentration, dass wir nicht durch Reinigung zu entfernen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar, dass Michela de Martino, Wilfred R. Hagen und Kourosh Honarmand Ebrahimi für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch eine Anschubfinanzierung von der Delft University of Technology unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number |
| BL21(DE3)pLysS competent cells | Promega | L1195 |
| pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 |
| HEPES | BDH | 441476L |
| Potassium hydroxide | Merck | 105033 |
| Sodium chloride | VWR | 443824T |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| Protease Inhibitor Cocktail Set III | EMD-Millipore | 539134 |
| DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare LS | 17-0851-01 |
| SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 |
| Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 |
| Ferrous Sulphate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8048 |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 |
| MOPS | Calbiochem | 475898 |
| SDS solution | Bio-Rad | 161-0418 |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 |
| Equipment | Company | Model |
| Static incubator | Hettich | INE500 |
| Shaking Incubator | New Brunswick Sc. | Inova 44 |
| Cooled centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Cell disrupter | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/AA |
| FPLC Purifier | General Electric | AKTA |
| Airtight vials | Cole-Parmer | EW-08918-85 |
| Syringe needles | BD | 305128 |
| Pipettes | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |
References
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