Toepassing van een<em> In vitro</em> DNA Protection Assay om stress Mediation Eigenschappen van de Dps Protein Visualiseer
Summary
De DNA-bindend eiwit van uitgehongerde cellen (DPS) speelt een cruciale rol in de strijd tegen bacteriële stress. Dit artikel bespreekt de zuivering van<em> E. coli</em> Dps en het protocol voor een<em> In vitro</em> Assay tonen Dps-gemedieerde bescherming van DNA tegen afbraak door reactieve zuurstof species.
Abstract
Oxidatieve stress is een onvermijdelijk bijproduct van aërobe leven. Moleculaire zuurstof is essentieel voor aardse stofwisseling, maar het neemt ook deel aan vele schadelijke reacties in levende organismen. De combinatie van aërobe metabolisme en ijzer, dat een essentieel samenstelling voor het leven, is voldoende om radicalen door Fenton chemie en degraderen cellulaire componenten. DNA-degradatie is misschien wel de meest schadelijke proces waarbij intracellulaire radicalen, zoals DNA-reparatie is verre van triviaal. De bepaling in dit artikel een kwantitatieve methode om het effect van moleculen en enzymen op radicaal-bemiddelde DNA beschadiging gemeten en gevisualiseerd.
De bescherming assay DNA is een eenvoudige, snelle en krachtige instrument voor de in vitro karakterisering van de beschermende eigenschappen van eiwitten of chemicaliën. Het DNA bestaat uit de blootstelling aan een schadelijke oxidatieve reactie en variërende concentraties van de verbinding van belang te voegen. De verlaging of verhoging van DNA schade als functie van verbindingconcentratie wordt gevisualiseerd middels gelelektroforese. In dit artikel tonen we de techniek van het DNA bescherming assay door het meten van de beschermende eigenschappen van het DNA-bindende eiwit van gedepriveerde cellen (Dps). Dps is een mini-ferritine die wordt gebruikt door meer dan 300 bacteriële soorten krachtig tegen milieu-invloeden. Hier presenteren we de Dps zuiveringsprotocol en de geoptimaliseerde testomstandigheden voor de evaluatie van bescherming DNA door Dps.
Introduction
Aërobe organismen dient steeds kampen met reactieve zuurstof species op hun DNA en andere belangrijke biologische macromoleculen kunnen beschadigen. Een krachtig middel om de toxische effecten van oxidatieve schade tegen het DNA-bindend eiwit van gedepriveerde cellen (Dps). Sinds zijn ontdekking in 1992 van uitgehongerde E. coli cultuur 1 is Dps geïdentificeerd in meer dan 300 soorten bacteriën en archaebacteriën 2. Massive opregulatie van Dps tijdens stationaire fase maakt het de meest sterk uitgedrukt nucleoid-geassocieerd eiwit van E. coli onder hongersnood voorwaarden 3, 4. Daarnaast heeft Dps is aangetoond dat zowel bacteriële levensvatbaarheid en DNA-integriteit tijdens de vele verschillende spanningen, waaronder honger, hoge ijzerconcentratie, blootstelling aan UV licht, warmte shock, en oxidatieve stress 5, 6 te bewaren.
Structureel, Dps self-vennoten in een stabiele homo-oligomere complex van 12 monomeren, which assembleren in een bolvormige holle schelp. De ~ 4,5 nm gehele inwendige holte is toegankelijk voor het uitwendige oplosmiddel via poriën die de passage van kleine moleculen 7 mogelijk en kan gemineraliseerde metalen zoals ijzer 8 sekwestreren. Het beschermende effect van Dps komt uit zijn verscheidene biochemische activiteiten, die niet-specifiek DNA-binding 1, ferroxidase activiteit en ijzeropslageiwit 8 omvatten.
Gedetailleerde studie van de gunstige biochemische activiteiten van Dps eerste vereist de zuivering ervan. Dps zuivering is een uitgebreide procedure zoals Dps niet alleen van andere eiwitten worden gescheiden, maar ook elk gebonden DNA 7. Onze geoptimaliseerde zuivering gebruikt veel voorkomende technieken, bestaande uit twee ionenuitwisselingskolommen en een ammoniumsulfaatprecipitatie stap. Verschillende buffer uitwisselingen zijn nodig, zoals sterk geconcentreerd Dps kan neerslaan uit de oplossing in zoutarm omstandigheden. Zodra Dps eiwit is gezuiverdHet kan worden toegepast op assays die zijn ferroxidase activiteit 8, DNA-bindingsstoichiometrie 9 en mechanismen van ijzerbindend 10 direct te meten. Gezuiverde Dps heeft ook andere mogelijke toepassingen. De stabiele holle sferische structuur van Dps is gebruikt als steigers voor opslag hydrofobe deeltjes in het eiwit holte 11 en zelfs als een reactiekamer om nieuwe magnetische nanodeeltjes synthetiseren 12.
Het beschermende vermogen van Dps om schade als gevolg van reactieve zuurstofradicalen bemiddelen kan duidelijk zijn en rechtstreeks aangetoond met behulp van de DNA-protectie-analyse 13, 14. In deze in vitro-procedure, worden radicalen geproduceerd wanneer ijzer katalyseert H 2 O 2 degradatie via Fenton chemie. Deze radicalen direct aanwezig DNA schade in de reactie en kan volledig degraderen bij hoge concentraties. Twee belangrijke Dps activiteiten kunnen zowel direct tegengaan van de effecten van Fenton-gemedieerde radicalen. Dps verlaagt de concentratie van katalytisch ijzer door mineralisatie, verbruiken de beschikbare waterstof-peroxide in het proces. Daarnaast Dps binden aan DNA kan mogelijk fysiek afschermen van radicale schade en condenseert het in een kleiner volume met minder reactief oppervlak. De combinatie van deze twee eigenschappen maakt de DNA protectie-analyse geschikt voor het meten beschermende Dps activiteit.
De bescherming assay DNA is zeer veelzijdig en kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van toepassingen buiten Dps karakterisatie. Radicalen is een veel voorkomende vorm van stress in cellen en vele verschillende eiwitten en chemicaliën worden gebruikt om het tegen. Het algemene principe van de assay, met behulp van DNA integriteit als een marker voor radicalen, kunnen worden gebruikt in combinatie met vrijwel elk radicaal-producerende reactie of tegengaan middel. Onder andere is de test met succes gebruikt om anti-oxidatieve eigenschappen te bepalenvan K. paniculata extract voor gebruik in de voedingsindustrie 15, om de effecten van urinezuur karakteriseren op hydroxyl schade bemiddeling 16, en nieuwe inzichten in de functie van Fur transcriptionele regulator eiwitten 17.
Ondanks de talrijke toepassingen van de assay in gepubliceerde artikelen, vonden we dat optimalisatietechnieken en probleemoplossingsstappen nodig waren, waardoor het opzetten van de test voor het eerst onnodig tijdrovend proces voor veel onderzoekers. Het protocol presenteren we in dit artikel is bedoeld om deze barrière voor vermelding te verwijderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het zuiveringsproces van Dps zoals beschreven in dit artikel is zeer robuust. Zuiverheid vaste hoog (> 99%), geen andere eiwitten op SDS-PAGE gels zichtbare banden. Ondanks dit, sommige batches van gezuiverd Dps lijken nucleaseactiviteit hebben, zoals blijkt uit de gedeeltelijke DNA-degradatie bij incubatie met zeer hoge concentraties van Dps. Dit zou de aanwezigheid van zeer actieve DNasen in een lage concentratie dat we niet in staat waren tot zuivering te verwijderen geven. Echter, dit DNA degradatie alleen waarge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor Michela de Martino, Wilfred R. Hagen, en Kourosh Honarmand Ebrahimi voor nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door de start-up financiering van de Technische Universiteit Delft.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number |
| BL21(DE3)pLysS competent cells | Promega | L1195 |
| pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 |
| HEPES | BDH | 441476L |
| Potassium hydroxide | Merck | 105033 |
| Sodium chloride | VWR | 443824T |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| Protease Inhibitor Cocktail Set III | EMD-Millipore | 539134 |
| DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare LS | 17-0851-01 |
| SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 |
| Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 |
| Ferrous Sulphate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8048 |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 |
| MOPS | Calbiochem | 475898 |
| SDS solution | Bio-Rad | 161-0418 |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 |
| Equipment | Company | Model |
| Static incubator | Hettich | INE500 |
| Shaking Incubator | New Brunswick Sc. | Inova 44 |
| Cooled centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Cell disrupter | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/AA |
| FPLC Purifier | General Electric | AKTA |
| Airtight vials | Cole-Parmer | EW-08918-85 |
| Syringe needles | BD | 305128 |
| Pipettes | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |
References
- Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli. Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).
- Chiancone, E., Ceci, P. The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding. Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).
- Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).
- Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter. Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).
- Martinez, A., Kolter, R. Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps. J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).
- Nair, S., Finkel, S. E. Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase. J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).
- Zhao, G., Ceci, P., et al. Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).
- Ceci, P., Cellai, S., et al. DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus. Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).
- Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core. J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).
- Swift, J., Wehbi, W. A., et al. Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities. Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).
- Ceci, P., Chiancone, E., et al. Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant. 화학. 16 (2), 709-717 (2010).
- Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties. The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).
- Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties. 생화학. 44 (15), 5572-5578 (2005).
- Kumar, M. Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage. Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).
- Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid. Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).
- Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress. The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).
- Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).
- Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. Serum iron determination using ferene triazine. Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).
