Применение<em> В пробирке</em> Защита ДНК Assay, чтобы визуализировать Стресс посредничеству свойствах белка Dps
Summary
ДНК-связывающими белка из голодающих клеток (Dps) играет решающей роли в борьбе бактериальные стресс. В данной статье рассматриваются очистки<em> E. палочка</em> Dps и протокол, для<em> В пробирке</em> Анализе демонстрируя Dps-опосредованной защиту ДНК, образующую от деградации активных форм кислорода.
Abstract
Окислительный стресс является неизбежной побочным продуктом аэробные жизни. Молекулярный кислород необходим для наземного метаболизм, но она также принимает участие во многих разрушительных реакции в живых организмах. Сочетание аэробного метаболизма и железа, что является еще одним жизненно важным соединением для жизни, достаточно для производства радикалов через химию Фентон и ухудшить клеточных компонентов. Деградации ДНК является, пожалуй, самым разрушительным процесс с участием внутриклеточные радикалы, как ДНК ремонт далека от тривиальными. Анализе представленные в этой статье предлагает количественные технику, чтобы измерять и визуализации эффекта молекул и ферменты на радикальных-опосредованной повреждения ДНК.
Анализе защита ДНК представляет собой простой, быстрым, и надежная инструментом для в характеристике пробирке из защитные свойства белки или химическими веществами. Она включает в себя подвергая ДНК, чтобы разрушительным реакции окислительного и добавление различными концентрациями представляющего интерес соединения. Уменьшение или увеличение из повреждение ДНК, как функцию от соединение концентрации затем визуализировал с использованием гель–электрофореза. В этой статье мы продемонстрировать технику из анализе защиту ДНК путем измерения защитных свойствах ДНК-связывающем белка из голодающих клеток (DPS). Dps представляет собой мини–ферритин, который используется более, чем на +300 бактериальный видов к мощно борьбы с экологических стрессоров. Здесь мы приводим протокол Dps очистки и оптимальных условий анализа для оценки защита ДНК от ДПС.
Introduction
Аэробные организмы должны постоянно утверждаю, с реактивных видов кислорода, которые могут повредить их ДНК, а также других решающий биологический макромолекулами. Один сильнодействующий инструмент, чтобы противодействовать токсических эффектов из окислительного повреждения является ДНК-связывающими белка из голодающих клеток (Dps). С момента своего открытия в 1992 году от голода E. палочка культура 1, Дата Dps была идентифицирована в более чем 300 видов бактерий и архебактерии 2. Массивные повышающая регуляция Dps во время стационарная фаза делает его наиболее экспрессируется на высоком уровне нуклеоидом-белок, ассоциированный с из E. палочка в условиях голода, условий 3, 4. Кроме того, Dps как было показано, сохранять как бактериальных, так жизнеспособность и ДНК целостность во время многие различных стрессов, в том числе голодание, высокая концентрация железо, воздействие УФ лучей света, тепла шок, и окислительного стресса 5, Отзывов: 6.
Структурно, Dps самоассоциатов в стабильную гомо-олигомерный комплекс из 12 мономеры, WHICH собираться в сферической полой оболочке. ~ 4.5 нм-широкий внутреннюю полость, является доступным для экстерьер растворитель через поры, которые позволить проход малых молекул, +7, и оно может секвестровать минерализованный металлы, такие как железо 8. Защитный эффект Dps вытекает из его на ряд биохимических деятельность, которая включает неспецифические ДНК-связывающий 1, ferroxidase активности, и железа хранения 8.
Подробные изучать полезные биохимические деятельностью Dps первая требует от своих очистки. Dps очистки является разработка процедуры, Dps должны быть разделены не только от других белков, но и от любой связанной ДНК 7. Наши оптимизированного процесса очистки использует многие общие методы, состоящий из двух ионообменных колонках и осаждение сульфатом аммония шаг. Несколько обмены буфер необходимы, в качестве высокой степенью концентрации Dps можете осаждаются из раствора в странах с низким условий солью. Как только Dps белок был очищенный, Оно может быть применены к анализов, которые непосредственно измерить его ferroxidase активность 8, ДНК-связывающими стехиометрией +9, а также механизмы из железо связывания +10. Очищенная Dps также имеет и другие потенциальных применений. Стабильная полые сферические структуры Dps был использован в качестве каркаса для хранения гидрофобных частиц внутри белковой полости 11 и даже в качестве реакционной камере, чтобы синтезировать новые магнитные наночастицы 12.
Защитный способность из Dps, чтобы посредничать повреждение из-за реактивных видов кислорода можете быть четко и в непосредственно продемонстрированный с использованием анализа ДНК защита 13, 14. В этой в процедуре пробирке, радикальными видов производятся, когда железо катализирует H 2 O 2 деградации через химию Фентон. Эти радикалы непосредственно повреждению ДНК, присутствующей в реакции, и может полностью деградировать его при высоких концентрациях. Два ключевых деятельностью Dps может как непосредственно, так противодействовать эффектам Fentна-опосредованной радикалов. Dps снижает концентрацию каталитический железо через минерализация, потребляя доступный перекись водород в этом процессе. Кроме того, Dps связыванию с ДНК может потенциально оградить его физически от радикальное повреждение и конденсирует его в меньший объем с менее реакционноспособной площадь поверхности. Сочетание этих две свойств делает анализе ДНК защита хорошо подходят для целью измерения защитной активностью Dps.
В анализе ДНК защита является достаточно универсальным и может быть использована для разнообразие применений, помимо характеризацию Dps. Радикальные повреждение является распространенной формой из стресс в клетках,, и много различных белки и химические вещества используются для противодействовать его. Общий принцип, из проведением теста, с использованием ДНК целостность в качестве маркера для радикальное повреждение, могут быть использованы в комбинации с почти любом радикальный-продуцирующей реакции или противодействующий агентом. Среди прочих, анализе была успешно использована чтобы определить, анти-окислительное свойстваиз К. метельчатая экстракта для использования в пищевой промышленность 15,, чтобы характеризовать эффекты мочевой кислоты на гидроксильных посредничеству повреждению 16, и, чтобы получить новых способность проникновения в суть образом нужен мех: транскрипционном белки регулятором 17.
Несмотря на многочисленными вариантами использования анализе в опубликованных работах, мы обнаружили,, что многие оптимизация и устранение неполадок шаги были требуется, что делает настройку методики для обнаружения в первый раз излишне трудоемкий процесс для многих исследователей. Протоколом мы представляем в этой статья призвана, чтобы удалить этот барьер для внесения записи.
Protocol
Representative Results
Discussion
Способ очистки по Dps, как описано в этой статье является очень надежным. Чистоты последовательно была высокими (> 99%); никакой другой белки не появляются на SDS-PAGE гели, как видимых полос. Несмотря на это, некоторые партии очищенного Dps, кажется, есть нуклеазная активность, о чем свидетельс?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Микела де Мартино, Уилфред Р. Хаген и Kourosh Honarmand Ebrahimi за полезные обсуждения. Этот работа выполнена при поддержке определенный начальный уровень финансирования от Дельфтского технологического университета.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number |
| BL21(DE3)pLysS competent cells | Promega | L1195 |
| pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 |
| HEPES | BDH | 441476L |
| Potassium hydroxide | Merck | 105033 |
| Sodium chloride | VWR | 443824T |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| Protease Inhibitor Cocktail Set III | EMD-Millipore | 539134 |
| DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare LS | 17-0851-01 |
| SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 |
| Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 |
| Ferrous Sulphate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8048 |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 |
| MOPS | Calbiochem | 475898 |
| SDS solution | Bio-Rad | 161-0418 |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 |
| Equipment | Company | Model |
| Static incubator | Hettich | INE500 |
| Shaking Incubator | New Brunswick Sc. | Inova 44 |
| Cooled centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Cell disrupter | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/AA |
| FPLC Purifier | General Electric | AKTA |
| Airtight vials | Cole-Parmer | EW-08918-85 |
| Syringe needles | BD | 305128 |
| Pipettes | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |
References
- Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli. Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).
- Chiancone, E., Ceci, P. The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding. Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).
- Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).
- Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter. Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).
- Martinez, A., Kolter, R. Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps. J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).
- Nair, S., Finkel, S. E. Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase. J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).
- Zhao, G., Ceci, P., et al. Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).
- Ceci, P., Cellai, S., et al. DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus. Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).
- Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core. J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).
- Swift, J., Wehbi, W. A., et al. Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities. Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).
- Ceci, P., Chiancone, E., et al. Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant. 화학. 16 (2), 709-717 (2010).
- Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties. The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).
- Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties. 생화학. 44 (15), 5572-5578 (2005).
- Kumar, M. Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage. Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).
- Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid. Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).
- Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress. The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).
- Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).
- Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. Serum iron determination using ferene triazine. Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).
