Mikroplade baserede procedurer er beskrevet for det kolorimetriske eller fluorometriske analyse af ekstracellulært enzymaktivitet. Disse procedurer giver mulighed for hurtig analyse af en sådan aktivitet i stort antal miljøprøver inden for et overskueligt tidsrum.
Meget af næringsstofomsætning og kulstof forarbejdning i naturlige miljøer det sker gennem aktiviteten af ekstracellulære enzymer frigivet af mikroorganismer. Således kan måling af aktiviteten af disse ekstracellulære enzymer giver indsigt i satserne for økosystemet niveau processer, såsom organisk stof nedbrydning eller kvælstof og fosfor mineralisering. Analyser af ekstracellulær enzymaktivitet i miljøprøver involverer typisk udsætte prøverne kunstige kolorimetriske eller fluorometriske substrater og sporing hastigheden af substrat hydrolyse. Her beskriver vi mikroplatte baserede metoder for disse procedurer, der tillader analyse af et stort antal prøver inden for en kort tidsramme. Prøverne får lov til at reagere med kunstige substrater i mikroplader med 96 brønde eller dyb brønd mikroplade blokke, og enzymaktiviteten efterfølgende bestemt ved absorption eller fluorescens af det resulterende slutprodukt anvendelse af en typisk mikroplade reader eller fluorometer. Sådanne high throughput procedurer ikke blot lette sammenligninger mellem rumligt forskellige steder eller økosystemer, men også i væsentlig grad reducere omkostningerne ved sådanne analyser ved at mindske de samlede reagens nødvendige per prøve mængder.
Mikroorganismer, såsom bakterier og svampe finde næringsstoffer og kulstof fra komplekse organiske forbindelser gennem produktion af ekstracellulære enzymer. Disse enzymer typisk hydrolysere polymerer i mindre underenheder, der kan tages i cellen. Derfor, ved et økologisk niveau disse mikrobielle ekstracellulære enzymer er ansvarlig for meget af næringsstof mineralisering og nedbrydning af organisk materiale, der forekommer i naturlige miljøer. Enzymer, såsom cellobiohydrolase (CBH), og β-glucosidase er vigtige for cellulose nedbrydning og arbejde i fællesskab at katalysere hydrolyse af cellulose til glucose 1,2, der tilvejebringer en anvendelige carbonsubstrat til mikrobiel optagelse og assimilation. Enzymet fosfatase frigiver opløselige uorganiske fosfat grupper fra organofosfater, hovedsagelig mineraliserende fosfat og gøre den tilgængelig til brug for de fleste organismer 3. Andre enzymer, såsom N-acetylglucosaminidase (NAGase) er important i kitin nedbrydning og kan gøre både kulstof og kvælstof til rådighed for mikrobiel erhvervelse 4..
En af de nærmere vilkår for analysen af mikrobiel ekstracellulær enzymaktivitet i naturlige miljøer er brugen af kunstige p-nitrophenyl (p NP) forbundne substrater, en tilgang, der oprindeligt blev udviklet til at detektere jord fosfataseaktivitet 5.. Denne tilgang er baseret på påvisning af et farvet slutprodukt, p-nitrophenol, som frigives, når den kunstige substrat hydrolyseres af det relevante enzym. P-nitrophenol kan efterfølgende kvantificeres kolorimetrisk ved at måle dets absorbans på omkring 400-410 nm. Denne metode er siden blevet anvendt til påvisning af andre enzymer, såsom NAGase 6, og har været anvendt i forskellige undersøgelser ser på mikrobiel ekstracellulære enzymaktivitet i jord og sedimenter 7-9.
En alternativ fremgangsmåde, der var originally udviklet til at vurdere ekstracellulær glucosidaseaktivitet i vandmiljøer 10,11 gør brug af 4-methylumbelliferon (MUB) i tilknytning substrater. Slutproduktet frigivet (4-methylumbelliferon) er meget fluorescerende og kan påvises ved hjælp af et fluorometer med en excitation / emission indstillingen omkring 360/460 nm. En række MUB forbundne kunstige substrater er til rådighed, tillader fluorometrisk måling af aktiviteten af mindst lige så mange enzymer (fx β-glucosidase, cellobiohydrolase, Nagase, phosphatase), som kan analyseres ved hjælp af p NP-substrat kolorimetrisk procedure. Andre mikrobielle ekstracellulære enzymer, såsom protein-nedbrydende leucinaminopeptidase, kan analyseres fluorometrisk under anvendelse af 7-amino-4-methylcoumarin (COU) i tilknytning substrater. Både MUB-og DA-forbundne substrater er blevet anvendt til at bestemme enzymaktivitet i forskellige terrestriske og akvatiske prøver 12,13.
Mens tidligere undersøgelser har descrIbed fluorometriske eller kolorimetrisk mikroplade tilgange til at bestemme ekstracellulær enzymaktivitet 14, og der er behov for en klar præsentation af, hvordan til at gennemføre sådanne analyser. Her vi demonstrere procedurer for højt gennemløb mikroplade teknikker til analyse af ekstracellulære enzymaktivitet i jord og sedimenter ved hjælp af kolorimetrisk p NP-bundne substrater tilgang og i naturlige farvande ved hjælp af fluorescerende MUB-bundne substrater teknik. Vi fokuserer på måling af aktiviteterne i β-glucosidase, NAGase, og phosphatase som disse enzymer kan bindes til carbon, nitrogen og fosfor cykling, hhv. Imidlertid kan de her beskrevne procedurer kan anvendes til måling af andre ekstracellulære enzymer ved hjælp af forskellige kunstige substrater.
Bestemmelse af aktiviteten af en række mikrobielle ekstracellulære enzymer i jord og sedimenter kan give nyttig indsigt i satserne for næringsstof mineralisering og organisk stof behandling 17. Men jordbunden kan variere i deres fugtniveau, så det er vigtigt at standardisere aktivitet i jorden tørvægt. Dette kræver et ekstra tørring trin (typisk af to dage) end blot at måle enzymaktivitet. Således i modsætning til assays af enzymaktivitet i vandprøver, der giver nær øjeblikkelige resultater, på…
The authors have nothing to disclose.
Midler til aspekter af dette arbejde blev leveret af forskellige kilder, herunder USA Department of Agriculture Specifik samarbejdsaftale 58-6408-1-595 og National Science Foundation (tildeling 1.049.911).
REAGENTS AND MATERIALS | |||
Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
Sodium acetate | Various suppliers | ||
Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
Pipette reservoir | Various suppliers | ||
EQUIPMENT | |||
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
8-channel pipettor | Various suppliers |