उच्च Throughput Microplate assays का उपयोग जल, मिट्टी, और तलछट में माइक्रोबियल कोशिकी एंजाइम गतिविधि का निर्धारण
Summary
Microplate आधारित प्रक्रियाओं बाह्य एंजाइम गतिविधि का वर्णमिति या fluorometric विश्लेषण के लिए वर्णित हैं. इन प्रक्रियाओं एक प्रबंधनीय समय सीमा के भीतर पर्यावरण के नमूनों की बड़ी संख्या में इस तरह की गतिविधि की तीव्र परख के लिए अनुमति देते हैं.
Abstract
प्राकृतिक वातावरण में पोषक तत्व सायकलिंग और कार्बन प्रसंस्करण की ज्यादातर सूक्ष्मजीवों द्वारा जारी कोशिकी एंजाइमों की गतिविधि के माध्यम से होता है. इस प्रकार, इन बाह्य एंजाइमों की गतिविधि की माप ऐसे कार्बनिक पदार्थ के अपघटन या नाइट्रोजन और फास्फोरस खनिज के रूप में पारिस्थितिकी तंत्र स्तर प्रक्रियाओं, की दरों में अंतर्दृष्टि दे सकते हैं. पर्यावरण के नमूने में बाह्य एंजाइम की गतिविधि assays आमतौर पर कृत्रिम वर्णमिति या fluorometric substrates के लिए नमूनों को प्रकाश में लाने और सब्सट्रेट hydrolysis की दर पर नज़र रखने शामिल है. यहाँ हम एक छोटी समय सीमा के भीतर नमूनों की बड़ी संख्या के विश्लेषण की अनुमति है कि इन प्रक्रियाओं के लिए microplate आधारित विधियों का वर्णन. नमूने microplate ब्लॉक microplates या गहरे कुएं 96 अच्छी तरह से भीतर कृत्रिम substrates के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति दी जाती है, और एंजाइम गतिविधि बाद एक ठेठ microplate Reade का उपयोग परिणामस्वरूप अंत उत्पाद का अवशोषण या प्रतिदीप्ति द्वारा निर्धारित किया जाता हैआर या fluorometer. इस तरह के उच्च throughput प्रक्रियाओं स्थानिक अलग साइटों या पारिस्थितिकी प्रणालियों के बीच तुलना की सुविधा है, लेकिन यह भी काफी नमूना प्रति जरूरत समग्र अभिकर्मक संस्करणों को कम करने से इस तरह के assays की लागत को कम करने के लिए न केवल.
Introduction
इस तरह के बैक्टीरिया और कवक के रूप में सूक्ष्मजीवों कोशिकी एंजाइमों के उत्पादन के माध्यम से जटिल कार्बनिक यौगिकों से पोषक तत्वों और कार्बन प्राप्त करते हैं. इन एंजाइमों आमतौर पर सेल में रखा जा सकता है कि छोटे यूनिटों में पॉलिमर hydrolyze. इसलिए, एक पारिस्थितिकी स्तर पर, इन माइक्रोबियल कोशिकी एंजाइमों पोषक खनिज और प्राकृतिक वातावरण में होता है कि कार्बनिक पदार्थ के अपघटन के अधिक के लिए जिम्मेदार हैं. ऐसे cellobiohydrolase (CBH) और β-ग्लुकोसिडेस के रूप में एंजाइमों माइक्रोबियल तेज और आत्मसात के लिए एक इस्तेमाल कार्बन सब्सट्रेट प्रदान करता है जो 1,2 ग्लूकोज में सेल्यूलोज की hydrolysis, उत्प्रेरित करने के लिए एक सुर में सेलूलोज गिरावट और काम के लिए महत्वपूर्ण हैं. एंजाइम फॉस्फेट organophosphates से घुलनशील अकार्बनिक फॉस्फेट समूहों, अनिवार्य रूप से फॉस्फेट mineralizing और सबसे जीवों 3 द्वारा उपयोग के लिए उपलब्ध बनाने विज्ञप्ति. जैसे एन acetylglucosaminidase (Nagase) के रूप में अन्य एंजाइमों, importan हैंकाइटिन गिरावट में टी और कार्बन और सूक्ष्म अधिग्रहण 4 के लिए उपलब्ध नाइट्रोजन दोनों कर सकते हैं.
प्राकृतिक वातावरण में माइक्रोबियल बाह्य एंजाइम गतिविधि की परख के लिए प्रक्रियाओं की एक कृत्रिम पी nitrophenyl (पी एन पी) जुड़ा हुआ substrates, मूल रूप से मिट्टी फॉस्फेट गतिविधि 5 पता लगाने के लिए विकसित किया गया था कि एक दृष्टिकोण का इस्तेमाल होता है. यह दृष्टिकोण कृत्रिम सब्सट्रेट उचित एंजाइम द्वारा hydrolyzed है जब जारी किया गया है जो एक रंग का अंत उत्पाद, पी nitrophenol, का पता लगाने पर निर्भर करता है. पी nitrophenol बाद में चारों ओर 400-410 एनएम पर अपनी absorbance को मापने के द्वारा colorimetrically मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इस विधि के बाद से इस तरह के Nagase के रूप में 6 अन्य एंजाइमों का पता लगाने के लिए लागू किया गया है, और मिट्टी और अवसादों 7-9 में माइक्रोबियल बाह्य एंजाइम की गतिविधि को देख विभिन्न अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है.
Originall था कि एक वैकल्पिक दृष्टिकोणY 10,11 4-methylumbelliferone (MUB) जुड़ा हुआ substrates का उपयोग करता है जलीय वातावरण में बाह्य ग्लुकोसिडेस गतिविधि का आकलन करने के लिए विकसित की है. (4 methylumbelliferone) जारी अंत उत्पाद अत्यधिक फ्लोरोसेंट है और 360/460 एनएम के आसपास एक उत्तेजना / उत्सर्जन की स्थापना के साथ एक fluorometer का उपयोग कर पाया जा सकता है. MUB से जुड़े कृत्रिम substrates के एक किस्म पी एनपी सब्सट्रेट वर्णमिति प्रक्रिया का उपयोग assayed किया जा सकता है के रूप में कम से कम के रूप में कई एंजाइमों (जैसे β-ग्लुकोसिडेस, cellobiohydrolase, Nagase, फॉस्फेट) की गतिविधि की fluorometric माप की अनुमति उपलब्ध हैं. ऐसे प्रोटीन अपमानजनक leucine Aminopeptidase के रूप में अन्य सूक्ष्म बाह्य एंजाइमों, 7 अमीनो-4-methylcoumarin (COU) जुड़ा हुआ substrates का उपयोग fluorometrically assayed किया जा सकता है. MUB और COU से जुड़े substrates दोनों विभिन्न स्थलीय और जलीय नमूने 12,13 में एंजाइम गतिविधि का निर्धारण किया गया है.
पिछले अध्ययनों descr है जबकिibed fluorometric या वर्णमिति microplate बाह्य एंजाइम गतिविधि 14 निर्धारित करने के लिए दृष्टिकोण, ऐसे assays का संचालन करने के लिए एक स्पष्ट प्रस्तुति के लिए एक की जरूरत है. यहाँ हम वर्णमिति पी एनपी से जुड़े substrates के दृष्टिकोण का उपयोग कर मिट्टी और अवसादों में और फ्लोरोसेंट MUB से जुड़े substrates तकनीक का उपयोग कर प्राकृतिक जल में बाह्य एंजाइम गतिविधि के विश्लेषण के लिए उच्च throughput microplate तकनीक के संचालन के लिए प्रक्रियाओं का प्रदर्शन. इन एंजाइमों क्रमशः, कार्बन, नाइट्रोजन, फास्फोरस और साइकिल के लिए बांधा जा सकता है के रूप में हम β-ग्लुकोसिडेस, Nagase, और फॉस्फेट की गतिविधियों की माप पर ध्यान केंद्रित. हालांकि, यहां वर्णित प्रक्रियाओं अलग कृत्रिम substrates का उपयोग अन्य बाह्य एंजाइमों की माप के लिए लागू किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
मिट्टी और तलछट में माइक्रोबियल कोशिकी एंजाइमों की एक किस्म की गतिविधि निर्धारण पोषक खनिज और कार्बनिक पदार्थ प्रसंस्करण 17 की दरों में उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. हालांकि, मिट्टी उनके न?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के पहलुओं के लिए अनुदान कृषि के संयुक्त राज्य अमेरिका विभाग विशिष्ट सहकारी समझौते 58-6408-1-595 और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (पुरस्कार 1049911) सहित विभिन्न स्रोतों द्वारा प्रदान किया गया.
Materials
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers |
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