Fastställande av mikrobiell extracellulär enzymaktivitet i Vatten, Jord och sediment med hjälp av hög genomströmning mikroplattor Analyser

Summary

Mikro baserade förfaranden beskrivs för kolorimetrisk eller fluorometrisk analys av extracellulär enzymaktivitet. Dessa förfaranden möjliggör en snabb analys av sådan verksamhet i ett stort antal miljöprover inom en hanterbar tidsram.

Abstract

En stor del av näringsomsättning och kol bearbetning i naturliga miljöer sker genom verksamheten vid extracellulära enzymer som frigörs av mikroorganismer. Således kan mäta aktiviteten av dessa extracellulära enzymer ge insikter i andelen ekosystem nivå processer, exempelvis nedbrytningen av organiskt material eller kväve-och fosformineralisering. Analyser av extracellulär enzymaktivitet i miljöprover vanligtvis att utsätta proverna till artificiella kolorimetriska eller fluorometriska substrat och spåra takten substrathydrolys. Här beskriver vi mikrobaserade metoder för dessa förfaranden som tillåter analys av ett stort antal prover inom en kort tidsram. Prover tilläts reagera med artificiella substrat inom 96-brunnars mikroplattor eller djup brunn mikro block, och enzymaktiviteten bestäms därefter genom absorption eller fluorescens av den resulterande slutprodukten med användning av en typisk mikrotiterplatta Reader eller fluorometer. Sådana hög genomströmning förfaranden inte bara underlätta jämförelser mellan rumsligt skilda platser eller ekosystem, men också avsevärt minska kostnaderna för sådana analyser genom att minska de totala reagensvolymer som behövs per prov.

Introduction

Mikroorganismer, såsom bakterier och svampar erhålla näringsämnen och kol från komplexa organiska föreningar genom produktionen av extracellulära enzymer. Dessa enzymer hydrolyserar vanligen polymerer i mindre subenheter som kan tas in i cellen. Därför, på en ekologisk nivå, dessa mikrobiella extracellulära enzymer är ansvariga för mycket av närings mineralisering och nedbrytningen av organiskt material som förekommer i naturliga miljöer. Enzymer såsom cellobiohydrolas (CBH) och β-glukosidas är viktiga för cellulosanedbrytning och arbetar unisont för att katalysera hydrolysen av cellulosa till glukos ^1,2, vilket ger ett användbart kolsubstrat för mikrobiell upptag och assimilering. Enzymet fosfatas släpper lösliga oorganiska fosfatgrupper från organiska fosforföreningar, huvudsakligen mineraliserings fosfat och göra den tillgänglig för användning av de flesta organismer ^3. Andra enzymer, såsom N-acetylglukosaminidas (NAGas), är important i kitin nedbrytning och kan göra både kol och kväve för mikrobiell förvärv ^4.

En av metoderna för analys av mikrobiell extracellulär enzymaktivitet i naturliga miljöer är att använda konstgjorda p-nitrofenyl (p NP) länkade substrat, en metod som ursprungligen utvecklades för att upptäcka jord fosfatasaktivitet ^5. Detta tillvägagångssätt förlitar sig på detektion av en färgad slutprodukt, p-nitrofenol, som frigörs när det artificiella substratet hydrolyseras av ett lämpligt enzym. Den p-nitrofenol kan därefter kvantifieras kolorimetriskt genom att mäta dess absorbans vid ca 400-410 nm. Metoden har sedan använts för att upptäcka andra enzymer såsom NAGas ^6, och har använts i olika studier att titta på mikrobiell cellulära enzymaktivitet i mark och sediment ^7-9.

Ett alternativt tillvägagångssätt som var originally utvecklats för att bedöma cellulära glukosidasaktivitet i vattenmiljöer ^10,11 använder sig av 4-metylumbelliferon (MUB) länkade substrat. Slutprodukten släpps (4-metylumbelliferon) är mycket fluorescerande och kan detekteras med användning av en fluorometer med excitering / emission inställning runt 360/460 nm. En mångfald MUB-länkade artificiella substrat finns tillgängliga, vilket medger den fluorometriska mätningen av aktiviteten av åtminstone så många enzymer (t.ex. β-glukosidas, cellobiohydrolas, Nagase, fosfatas) som kan analyseras med användning av p NP-substrat kolorimetrisk procedur. Andra mikrobiella extracellulära enzymer, såsom proteinnedbrytande leucinaminopeptidas, kan analyseras fluorometriskt med användning av 7-amino-4-metylkumarin (COU) kopplade substrat. Både MUB-och COU-länkade substrat har använts för att bestämma enzymaktivitet i olika land-och vattenmiljöer prover ^12,13.

Även tidigare studier har described fluorometriska eller kolorimetrisk mikro metoder för att bestämma cellulära enzymaktivitet ^14, det finns ett behov av en tydlig redovisning av hur man genomför sådana analyser. Här visar vi rutiner för hög genomströmning mikrotekniker för analys av extracellulär enzymaktivitet i mark och sediment med hjälp av kolorimetriska p NP bundna substrat strategi och i naturliga vatten med hjälp av fluorescerande MUB bundna substrat teknik. Vi fokuserar på mätning av verksamheten i β-glukosidas, NAGas, och fosfatas eftersom dessa enzymer kan knytas till kol, kväve och fosfor cykling, respektive. Emellertid kan de förfaranden som beskrivs här tillämpas på mätning av andra extracellulära enzymer med användning av olika artificiella substrat.

Protocol

Kolorimetrisk analys av extracellulärt enzym aktivitet i mark och sediment 1. Beredning av substrat och buffertlösningar för Kolorimetriska analyser av enzymaktivitet Förbered 50 mM acetatbuffert (pH 5,0 till 5,5) genom att blanda 50 ml 0,1 M ättiksyra (2,87 ml isättika i 500 ml vatten), 150 ml 0,1 M natriumacetat och 200 ml destillerat H2O Justera pH till 5,0-5,5 med 0,1 M ättiksyra vid behov. Bered en lösning av 1 M natriumhydroxid (NaOH) i destillerat …

Representative Results

Jord-och vattensediment har normalt betydande halter av extracellulär enzymaktivitet till följd av bifogade mikrobiella samhällen (biofilmer) som växer på ytan av partiklar Figur 3 visar hur denna verksamhet varierar beroende på storleken av partiklar som erhållits från ytsediment av en tredje. För ström i norra Mississippi, USA. En tidigare studie har visat att bakteriesamhällen på sedimentpartiklar från denna ström kan delas in i tre olika grupper baserat på molekylär analys av deras s…

Discussion

Fastställande av aktiviteten av en mängd olika mikrobiella cellulära enzymer i mark och sediment kan ge värdefulla insikter om andelen näringsämnen mineralisering och organiskt material bearbetning ^17. Emellertid kan jordar varierar i sina fuktnivåer, så det är viktigt att standardisera aktivitet till jord torrvikt. Detta kräver ett ytterligare torkningssteg (typiskt av två dagar) utöver att bara mätning av enzymaktivitet. Således, i motsats till analyser av enzymaktivitet i vattenprover som ger…

Materials

			REAGENTS AND MATERIALS
Glacial acetic acid			Various suppliers
Sodium acetate			Various suppliers
Sodium hydroxide			Various suppliers
p-Nitrophenol	Fisher	BP612-1	Alternates available
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate	Sigma	N3234	pNP-substrate
pNP-β-glucopyranoside	Sigma	N7006	pNP-substrate
pNP-β-N-acetylglucosaminide	Sigma	N9376	pNP-substrate
Clear 96-well microplates	Fisher	12-563-301	Alternates available
96-well deep well blocks	Costar	3958	Alternates available
Aluminum weigh pans			Various suppliers
Sterile 15 ml centrifuge tubes			Various suppliers
Sterile 50 ml centrifuge tubes			Various suppliers
4-Methylumbelliferone	Sigma	M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate	Sigma	M8883	MUB-substrate
4-MUB-glucopyranoside	Sigma	M3633	MUB-substrate
4-MUB-N-acetylglucosaminide	Sigma	M2133	MUB-substrate
Sodium bicarbonate			Various suppliers
Black 96-well microplate	Costar	3792
Pipette reservoir			Various suppliers
			EQUIPMENT
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge rotor	Eppendorf	A-4-81	For microplates/deep-well blocks
Microplate reader	BioTek	Synergy HT	Alternates available
Microplate fluorometer	BioTek	FLx 800	Alternates available
8-channel pipettor			Various suppliers