Implementar Clamp dinámico con conductancias sinápticas y artificiales en células de ratón ganglionares retinianas

Summary

Este artículo de vídeo ilustra los set-up, los procedimientos para remendar los cuerpos celulares y cómo implementar clamp grabaciones dinámicas de las células ganglionares de todo el montaje del ratón retinas. Esta técnica permite la investigación de la contribución precisa de entradas sinápticas excitatorias e inhibitorias, y su magnitud relativa y el momento para spiking neuronal.

Abstract

Las células ganglionares son las neuronas de salida de la retina y su actividad refleja la integración de múltiples entradas sinápticas derivados de circuitos neuronales específicas. Técnicas de patch clamp, de fijación de voltaje y configuraciones de corriente con la pinza, se utilizan comúnmente para estudiar las propiedades fisiológicas de las neuronas y caracterizar sus entradas sinápticas. Aunque la aplicación de estas técnicas es altamente informativo, plantean varias limitaciones. Por ejemplo, es difícil de cuantificar cómo las interacciones exactas de las entradas excitadoras e inhibidoras determinan de salida de respuesta. Para solucionar este problema, se utilizó una técnica de modificación actual abrazadera, abrazadera dinámica, también llamada la conductancia abrazadera ^{1, 2, 3} y examinamos el impacto de entradas sinápticas excitatorios e inhibitorios sobre la excitabilidad neuronal. Esta técnica requiere la inyección de corriente en la célula y es dependiente de la retroalimentación en tiempo real de su potencial de la membrana en ese momento. El injectéd actual se calcula a partir predeterminados conductancias sinápticas excitatorias e inhibitorias, sus potenciales de inversión y instantánea potencial de membrana de la célula. Los detalles de los procedimientos experimentales, patch clamp células para lograr una configuración de célula y el empleo de la técnica de sujeción dinámico se ilustran en este artículo de vídeo. Aquí, se muestra las respuestas de las células ganglionares de la retina de ratón para varias formas de onda de la conductancia obtenido a partir de experimentos fisiológicos en condiciones de control o en la presencia de drogas. Además, se muestra el uso de las conductancias excitatorios e inhibitorios artificiales generados usando funciones alfa para investigar las respuestas de las células.

Introduction

La retina es un tejido neural casi transparente que recubre la parte posterior del ojo. Muchos estudios utilizan la retina como modelo para investigar los primeros pasos en el procesamiento visual y los mecanismos de señalización sináptica. Dado que la red de la retina en la preparación de todo el montaje se mantiene intacta después de la disección, se representa un sistema ideal para estudiar las interacciones sinápticas como sus respuestas fisiológicas son muy similares a las condiciones in vivo. Por lo tanto, el uso de una retina aislada de las propiedades de las neuronas puede ser estudiado mediante técnicas de patch clamp (para revisiones en la técnica, véase ^6,9,13). Identificación de la contribución exacta de los circuitos y los neurotransmisores a la respuesta de células ganglionares específicos, sin embargo, se ve obstaculizada por lo general como agentes farmacológicos actúan en varios sitios.

Respuestas fisiológicas de neuronas de la retina a la luz, el estímulo natural se pueden grabar con pipetas de vidrio llenos de líquido intracelular. Con cl patchtécnicas de amplificación, las respuestas neuronales a la estimulación de luz se pueden grabar como membrana fluctuaciones potenciales (pinza de corriente) o como corrientes (fijación de voltaje). Al mantener el potencial de membrana a diferentes voltajes y la implementación de un análisis de la conductancia a posteriori, es posible aislar entradas sinápticas inhibitorias y excitatorias ^5,12. Este tipo de experimentos se puede llevar a cabo en un medio de baño normal y en la presencia de diferentes agentes farmacológicos para aislar la contribución de los diferentes neurotransmisores y receptores a las respuestas neuronales. Una gran cantidad de estudios de muchos laboratorios caracteriza la dependencia de la adición de salida y entradas excitatorias e inhibitorias en las propiedades de estímulo, como el tamaño, el contraste, las frecuencias espaciales y temporales, la dirección, orientación y otras variables de estímulo. Aunque estos enfoques experimentales proporcionan información acerca de la relación entre la salida de pico y entradas sinápticas como una función de las propiedades de estímulo,interpretación de la contribución de los tipos de células específicas y de sus entradas sinápticas a la excitabilidad celular no es sencillo. Esto es debido al hecho de que los insumos típicamente tanto excitatorios e inhibitorios varían con las propiedades de estímulo y, por tanto, no es posible evaluar el impacto preciso que los cambios en cualquiera de estas entradas tiene en spiking neuronal.

Un enfoque alternativo para eludir estas limitaciones es para llevar a cabo abrazadera grabaciones dinámicos, que permiten una evaluación crítica de la contribución de las entradas sinápticas individuales para clavar de salida. La técnica de la pinza dinámica permite la inyección directa de la corriente en la célula y la cantidad de corriente inyectada en un momento dado depende del potencial de membrana registrada en ese momento ^1,2,3 (para una revisión, ver ^7,14). Se trata de una pinza de corriente modificada configuración donde a, interacción rápida retroalimentación en tiempo real entre la célula en la grabación y el equipo que comprende hardware especializado, softwarey se logra un ordenador. La cantidad de corriente inyectada en la célula se calcula en consecuencia. Por lo tanto, la ventaja de este método es que la célula puede ser estimulada con diferentes combinaciones de formas de onda de la conductancia, y su respuesta se imitan la activación de los receptores que median las entradas sinápticas. Por ejemplo, la comparación de la respuesta a la inyección de las conductancias de excitación e inhibición para una pequeña mancha con la respuesta a la inyección de la conductancia excitador para un pequeño punto sólo proporciona información sobre el impacto de la inhibición de la respuesta celular. Del mismo modo, otras combinaciones de conductancias registrados fisiológicamente pueden ser co-inyectaron a revelar cómo estímulo dependiente de los cambios en las conductancias excitatorios y / o inhibidor afecta a la salida pico.

En nuestro estudio, la técnica de la pinza dinámica se utiliza para demostrar el impacto de la amplitud relativa y el momento de entradas sinápticas sobre las propiedades de disparo de las células ganglionares de la retina. Varios conductanciasobtenido a partir de experimentos fisiológicos en condiciones de control o en presencia de agentes farmacológicos fueron empleados como entradas. Además, también se utilizaron las conductancias artificiales basados ​​en funciones alfa con el fin de investigar cómo entradas sinápticas están integrados por las neuronas. Por lo tanto esta es una técnica versátil que permite distintos tipos de conductancia generado ya sea fisiológicamente, farmacológicamente o computacionalmente para ser inyectada en la misma célula ganglionar, lo que la comparación de las respuestas a estas entradas se puede hacer.

Protocol

1. Configuración general y preparación de tejidos Mantenga el puntero del ratón en la oscuridad durante 30 min (tratar de reducir su nivel de estrés). Mientras espera, preparar 1 l de solución extracelular. En primer lugar se disuelven 1,9 g de bicarbonato de sodio en medio de un litro de agua Milli-Q. Su pH se mantiene en el 7,4 por burbujeo con un 95% de O2 y 5% de CO 2. Cinco minutos más tarde, se disuelven 8,8 g de Ames Medio en 100 ml de agua Milli-Q, se suman a la solución d…

Representative Results

La contribución de las diferentes fuentes de entradas inhibitorias a las respuestas de células ganglionares se demuestra a través de la aplicación de diversas formas de onda de la conductancia. Estas formas de onda se obtuvieron con estímulos de diferente luminancia en condiciones normales y en presencia de TTX, Na + dependiente de voltaje bloqueador de los canales que bloquea la generación de potencial de acción sólo en un subconjunto de interneuronas inhibidoras de la retina. Figura 2A</stro…

Discussion

Aquí se muestra el uso de la abrazadera dinámico para evaluar la influencia de la relación y la temporización relativa de la excitación y la inhibición en la producción de células ganglionares de la retina. Abrazadera dinámica hace uso de simulaciones por ordenador para introducir conductancias sinápticas fisiológicamente grabados o artificiales en neuronas vivas. Esta metodología proporciona una herramienta interactiva por el cual las conductancias pueden ser modificados y se inyecta en las neuronas para ca…

Materials

			Reagent
Isoflurane Inhalation Anaesthetic	Pharmachem
Ames Medium with L-Glutamate (Powder)	Sigma-Aldrich
Potassium Gluconate, Anhydrous	Sigma-Aldrich
HEPES Sodium salt	Sigma-Aldrich
Magnesium chloride solution (4.9 mol/l)	Sigma-Aldrich
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde Powder, 95%	Sigma-Aldrich
Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)	Invitrogen
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml	Invitrogen
Fluorescent Preserving Media	BioFX Laboratories Inc.
			Equipment
Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)	Warner Instruments	64-0794
Single Stage Glass Microelectrode Puller	Narishinge Japan	Model PP-830
Minipuls 2	Gilson
Millex-GV 0.22 μm Filter Unit	Millipore Corporation	SLGV004SL
Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G	Smith & Nephew (Australia)
Single Inline Solution Heater	Warner Instruments	Model SH-27B
Dual Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B
Olympus Stereomicroscope SZ61	Olympus Corporation
Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective	Olympus Corporation
0-30 V 2.5 A DC Power Supply	Dick Smith Electronics	Q1770
Digital Microscopic Camera ProgResMF cool	Jenoptik
Micromanipulator MP-225	Sutter Instrument Company
Patch Clamp Amplifier EPC 8	HEKA Elektronik
InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System	HEKA Elektronik
Computer: DELL	Dell Corporation