Implementieren Dynamische Clamp mit Synaptic und künstliche Leitfähigkeiten in Maus retinalen Ganglienzellen
Summary
Dieses Video zeigt die Artikel-Set-up, die Verfahren zum Zellkörper patchen und wie man dynamische Clamp Messungen von Ganglienzellen in whole-mount Maus retinae umzusetzen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der genauen Anteil von erregenden und hemmenden synaptischen Eingänge und ihre relative Größe und den Zeitpunkt zu neuronalen Spiking.
Abstract
Ganglienzellen sind die Ausgangs-Neuronen der Netzhaut und ihre Tätigkeit spiegelt die Integration von mehreren synaptischen Eingänge auf Grund von spezifischen neuronalen Schaltkreisen. Patch-Clamp-Technik, in Voltage-Clamp und Stromzange Konfigurationen, werden häufig verwendet, um die physiologischen Eigenschaften von Neuronen zu untersuchen und ihre synaptischen Eingänge zu charakterisieren. Obwohl die Anwendung dieser Techniken ist sehr informativ, stellen sie verschiedene Einschränkungen. Zum Beispiel ist es schwierig zu quantifizieren, wie die genauen Wechselwirkungen der erregenden und hemmenden Eingänge Antwortausgabe bestimmen. Um dieses Problem anzugehen, verwendeten wir eine modifizierte Strom-Clamp-Technik, dynamische Klemme, die auch als Leitwert Klemme 1, 2, 3 und untersuchte den Einfluss von erregenden und hemmenden synaptischen Eingänge auf die neuronale Erregbarkeit. Diese Technik erfordert die Injektion von Strom in die Zelle und ist abhängig von der Echtzeit-Feedback der Membranpotential zu dieser Zeit. Die INJECTEd Strom von vorgegebenen erregende und hemmende synaptische Leitwerte, ihre Potenziale und Umkehrung der Zelle momentanen Membranpotential berechnet. Details zu den experimentellen Verfahren werden Patch-Clamp-Zellen, um eine Whole-Cell-Konfiguration und Einsatz der dynamischen Clamp-Technik erreichen in diesem Video-Artikel dargestellt. Hier zeigen wir die Antworten der Maus retinalen Ganglienzellen auf verschiedene Wellenformen Leitwert von physiologischen Experimenten unter Kontrolle Bedingungen oder in Gegenwart von Medikamenten erhalten. Darüber hinaus zeigen wir die Verwendung von künstlichen erregenden und hemmenden Leitwerte generiert unter Verwendung von Alpha-Funktionen, um die Reaktionen der Zellen zu untersuchen.
Introduction
Die Netzhaut ist eine nahezu transparente neuronalen Gewebe an der Rückseite des Auges. Viele Studien verwenden die Netzhaut als Modell, um die ersten Schritte in der visuellen Verarbeitung und Mechanismen der synaptischen Signalisierung zu untersuchen. Da die Netzhaut Netzwerk in der whole-mount Vorbereitung bleibt nach Dissektion, stellt es ein ideales System, um synaptische Interaktionen zu untersuchen, wie ihre physiologischen Reaktionen sehr ähnlich zu der in vivo-Bedingungen sind. Somit ist die Verwendung eines isolierten Netzhaut die Eigenschaften der Neuronen untersucht mittels Patch-Clamp-Verfahren (für Bewertungen auf der Technik, siehe 6,9,13) werden kann. Ermittlung des genauen Beitrag der spezifischen Schaltungen und Neurotransmitter Ganglienzellen Reaktion wird jedoch üblicherweise behindert als pharmakologische Wirkstoffe an unterschiedlichen Standorten handeln.
Physiologische Reaktionen von retinalen Neuronen mit Licht, die natürliche Reiz, kann mit Glas-Pipetten mit intrazellulären Flüssigkeit gefüllt aufgezeichnet werden. Mit Patch clamp Techniken, neuronale Reaktionen auf Licht Stimulation kann als Membranpotential Schwankungen (Stromzange) oder als Ströme (Voltage-Clamp) aufgezeichnet werden. Durch Halten des Membranpotentials mit unterschiedlichen Spannungen und Umsetzung einer posteriori Leitfähigkeit Analyse ist es möglich, zu isolieren und hemmende erregenden synaptischen Eingänge 5,12. Diese Art der Experimente sind in normalen Badmedium und in Gegenwart von verschiedenen pharmakologischen Mitteln, um den Beitrag von verschiedenen Neurotransmittern und Rezeptoren auf neuronale Reaktionen isolieren durchgeführt werden. Eine Fülle von Studien aus vielen Laboratorien dadurch die Abhängigkeit der Spick-Ausgang und erregenden und hemmenden Eingänge Reiz Eigenschaften wie Größe, Kontrast, räumlichen und zeitlichen Frequenzen, Richtung, Orientierung und anderen Stimulus Variablen. Obwohl diese experimentelle Ansätze liefern Informationen über die Beziehung zwischen Spike Ausgang und synaptische Eingänge in Abhängigkeit von Stimulus-Eigenschaften,Interpretation des Beitrags spezifische Zelltypen und deren synaptische Eingänge Zellerregbarkeit ist nicht einfach. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass in der Regel sowohl erregenden und hemmenden Eingänge mit Stimulus Eigenschaften variieren und somit ist es nicht möglich, die genaue Wirkung, dass Änderungen in diesen beiden Eingängen auf neuronale Spiking bewerten.
Ein alternativer Ansatz, diese Einschränkungen zu umgehen, ist die Durchführung von dynamischen Clamp Messungen, die eine kritische Bewertung des Beitrags der einzelnen synaptischen Eingänge Spick Ausgang zu ermöglichen. Die dynamische Clamp-Technik erlaubt die direkte Injektion von Strom in die Zelle und die Menge der injizierten Strom zu einem bestimmten Zeitpunkt hängt von der aufgezeichneten Membranpotential damals 1,2,3 (für eine Übersicht siehe 7,14). Es ist eine modifizierte Stromzange Set-up, wo ein Echtzeit-, schnelles Feedback Interaktion zwischen der Zelle unter Aufnahme und der Ausrüstung, die spezielle Hardware, Softwareund einen Computer erzielt wird. Die Strommenge, die in die Zelle injiziert wird entsprechend berechnet. Daher ist der Vorteil dieses Verfahrens, dass die Zelle mit verschiedenen Kombinationen von Leitfähigkeit Wellenformen stimuliert werden kann, und die Antwort wird die Aktivierung von Rezeptoren, die synaptischen Eingänge vermitteln imitieren. Zum Beispiel der Vergleich der Reaktion auf Injektion von erregenden und hemmenden Leitwerte für einen kleinen Ort mit der Antwort auf Injektion von erregenden Leitwert für einen kleinen Ort nur Informationen über die Auswirkungen der Hemmung auf Zell-Antwort. Ebenso können andere Kombinationen von physiologisch aufgezeichnet Leitwerte co-injiziert werden zu zeigen, wie Stimulus-abhängigen Veränderungen in erregenden und / oder hemmenden Leitfähigkeiten beeinflussen Spike Ausgang.
In unserer Studie wird die dynamische Clamp-Technik verwendet, um die Auswirkung der relativen Amplitude und Zeitpunkt der synaptischen Eingänge der Brenneigenschaften von retinalen Ganglienzellen demonstrieren. Verschiedene Leitwerteerhalten von physiologischen Experimente in Steuerbedingungen oder in Gegenwart von pharmakologischen Mitteln wurden als Eingänge verwendet. Darüber hinaus wurden künstliche Leitwerte auf alpha-Funktionen basierend auch verwendet werden, um zu untersuchen, wie synaptische Eingänge von den Neuronen integriert sind. Somit ist eine vielseitige Technik, die verschiedene Typen von Leitfähigkeit erzeugt entweder physiologisch oder pharmakologisch rechnerisch in die gleiche Ganglienzellen injiziert werden, so Vergleich der Antworten auf diese Eingaben vorgenommen werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier zeigen wir die Verwendung von dynamischen Haken, um den Einfluß des Verhältnisses und Timing der Erregung und Hemmung von retinalen Ganglienzellen Ausgang bewerten. Dynamische Klammer nutzt Computersimulationen physiologisch aufgezeichneten oder künstliche synaptischen Leitwerte in lebende Neuronen einzuführen. Diese Methode bietet ein interaktives Werkzeug, mit dem Leitwerte können modifiziert werden und injiziert in Neuronen zur Berechnung ihres Einflusses auf neuronalen Antworten. Leitwert Wellenformen von …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird durch das Australian Research Council (ARC DP0988227) und der Biomedical Science Research Initiative Zuschuss der Disziplin der biomedizinischen Wissenschaft, The University of Sydney unterstützt. Die Ausrüstung Patch-Clamp-Verstärker EPC 8 wurde von der Startup Fund aus der Disziplin der biomedizinischen Wissenschaft, The University of Sydney finanziert. Die Ausrüstung InstruTECH LIA 8 +8 Datenerfassungssystem wurde mit den Mitteln aus Rebecca L. Cooper Foundation und Startup Fund aus der Disziplin der biomedizinischen Wissenschaft, The University of Sydney gekauft. Wir möchten den anonymen Gutachtern für ihre aufschlussreichen Anregungen und Kommentare danken.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Microelectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith & Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation |
References
- Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
- Johnson, D., Wu, S. M. -. S. . Foundations of cellular neurophysiology. , (1995).
- Taylor, W. R., Vaney, D. I. Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina. Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).
- Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. The patch clamp technique in ion channel research. Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
- Williams, S. R. Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).
- Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
- Feng, S. S., Jaeger, D. The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study. Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).
- Butera, R., Lin, R., Destexhe, A., Bal, T. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. 1, (2009).
- Marco, S. D. i., Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation. The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).
- Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).
- Lobb, C. J., Paladini, C. A. Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique. J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Middleton, T. P., Protti, D. A. Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells. Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).
- Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina. J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).
