Genetisk Manipulation af musen Udvikling Hypothalamus gennem<em> In Utero</em> Elektroporering
Summary
Trods den funktionelle og medicinske betydning af hypothalamus,<em> In utero</em> Genmanipulation af sin udvikling er sjældent blevet forsøgt. Vi viser en detaljeret procedure for<em> In utero</em> Elektroporation i musen hypothalamus og viser repræsentative resultater af total og delvis (regional) hypothalamus transfektion.
Abstract
Genetisk modifikation af specifikke regioner i udviklingslandene pattedyrs hjerne er en meget kraftfuld eksperimenterende tilgang. Imidlertid genererer nye mus mutanter er ofte frustrerende langsomme. Det har vist sig, at adgangen til musehjernen udvikler i livmoderen med rimelig post-operatory overlevelse er mulig. Alligevel har resultater med denne procedure blevet rapporteret næsten udelukkende til det mest overfladiske og let tilgængelige del af hjernens udvikling, dvs cortex. Thalamus, en smallere og mere mediale region, har vist sig sværere at målet. Transfektion i dybere kerner, især dem i hypothalamus, er måske den mest udfordrende, og derfor meget få resultater er blevet rapporteret. Her viser vi en procedure for at målrette hele hypothalamus neuroepithelium eller en del af det (hypothalamus regioner) til transfektion via elektroporation. Nøglerne til vores tilgang er længere narkose tider, injektion i tHird ventrikel, og passende form og placering af elektroderne. Derudover viser vi resultaterne af målretning og efterfølgende histologisk analyse af de mest forsænket hypothalamus kerne, det mammillary kroppen.
Introduction
Genetisk manipulation af embryonale muse hjerne er en foretrukken metode til at lære om udviklingsmæssige regulering. Generering af mutante muselinjer dog er langsomt og dyrt. En kraftfuld metode til at indføre særlige genetiske ændringer i udviklingen neuroner i pattedyrs hjerne er i livmoderen elektroporation. Dybest set Teknikken består i at transficere DNA i embryonale hjerne neuroepithelium ved hjælp af elektriske impulser, derefter lade embryonet til at overleve en vis periode, indsamle hjernen og undersøge dem for mulig roman, informative fænotyper. På denne måde, kan forsøgslederen teste hypoteser næsten øjeblikkeligt uden lange ventetider er nødvendige for produktionen af muse-mutanter.
Transfektion af DNA i fostre startede med in ovo elektroporation på kyllingefostre 1.. Den væsentlige proof-of-concept for musen blev udført i kultur <sup> 2.. Dette blev hurtigt efterfulgt af de første beskrivelser af teknikken på musen i livmoderen 3,4.
Det vigtigste problem er at transficere hjernen af embryoner udvikler i livmoderen uden at dræbe dem eller moderen. At lære at udføre den nødvendige kirurgi (laparotomi, injektion, elektroporation) kræver en lang uddannelsesperiode. Når operationen er blevet mestret til det punkt, hvor embryo overlevelse forholdet er acceptabel, er det næste centrale spørgsmål er: hvilke hjernens strukturer er tilgængelige? Ikke overraskende, de første offentliggjorte papirer viser resultater opnået med in utero elektroporation fokus på kortikal udvikling 5-9. Dette er stadig sandt for de fleste af de publikationer ved hjælp af denne teknik, da regionen udviklingslandene musehjerne mest tilgængelige for kirurgiske procedurer er cortex (figur 1). Proceduren for in utero elektroporation i cortex er blevet beskrevetpå tryk 10 og i video 11-14. En modifikation af teknikken kan anvendes til at målrette en ventral del af telencephalon, basalganglierne 15..
Ud telencephalon, er diencephalon (klassisk opdelt i thalamus og hypothalamus) en region i forhjernen mere vanskeligt at nå. Et lille antal papirer rapporter målrettet sin ryg og mest tilgængelige del, thalamus 16-19.
Hypothalamus er den mest ventrale del af forhjernen, derfor den ene lokaliserede mest dybt fra den dorsale overflade (cortex) (figur 1). Denne region er fortsat en vanskelig udfordring for forskerne forpligtet til genetisk manipulere musehjernen i livmoderen. Til vores viden, melder kun meget få artikler om resultaterne af i livmoderen transfektion i musen hypothalamus 20,21. Men den funktionelle betydning af hypothalamus cannot overvurderes, da det regulerer adfærd som at spise og drikke, parring, avl og forældreskab 22.. Desuden ændringer i hypothalamus udvikling bidrager til at stamme senere i livsbetingelser som fedme, forhøjet blodtryk, diabetes og tidlig pubertet 23.. At være i stand til at ændre genetisk hypothalamus under udvikling vil give et meget kraftfuldt værktøj til at forstå det.
Den grundlæggende kirurgiske protokol for laparotomi af gravide mus, som vi bruger her, er magen til den, der anvendes i de andre protokoller 11,13,14,24. Vi vil beskrive dem her kort for fuldstændighedens. Nøglen til vores procedure på den anden side er typen af anæstesi, stedet for indsprøjtning, typen af elektroder og indsættelse og placering af den positive elektrode med hensyn til fosterets hoved. Vi foretrækker at inducere og vedligeholde anæstesi gennem gas indånding løbet enkel intraperitoneal anæstesi, idet førstnævnte giver mulighed forlidt længere narkose kræves for en vanskelig operation. Isofluran inhalation medfører hurtigere helbredelse fra anæstesi, da regel moderen demonstrerer normal adfærd allerede få minutter efter operationen. Den nemmeste punktet af indsprøjtning af DNA opløsningen med glasmikropipette er den laterale ventrikel, som dog er helt uegnet til hypothalamus elektroporation. Injektion direkte i den tredje ventrikel er helt afgørende at målrette dybe diencephalic strukturer. Det er muligt at transfektere hypothalamus fra E12.0 eller E12.5 med standard, off-the-shelf elektroder. Vi har fundet nogle af elektroderne fremstillet af Nepa Gene (Chiba, Japan) særligt velegnet til dette formål.
Med vores procedure opnår vi transfektion af hele hypothalamisk neuroepithelium eller delvis, regional transfektion afhængigt elektrode orientering. Her har vi demonstrere teknikken ved transfektion af mammillary kroppen, velsagtensden dybeste og mest forsænket fremmest hypothalamus kerner. Derudover viser vi detaljeret histologisk analyse af de transficerede celler ned til celleniveau af opløsning.
En sammenligning af in utero elektroporation med andre tilgange til transfektion af mus hjernens udvikling i livmoderen kan findes i Discussion afsnit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om anæstesi: Da i livmoderen elektroporation i hypothalamus kan være teknisk vanskelig og kræve længere bedøvelsestilstand gange, vi foretrækker at inducere og vedligeholde anæstesi gennem administration af en blanding af oxygen og isofluran. Det er vores erfaring, kan dyrene forbliver passende bedøvet på denne måde i perioder på op til en time i det mindste, inddrivelse af moderen er meget hurtigt, og embryo overlevelse forbedres. Andre tilgange til anæstesi er også tilgængelige. Den mest enkle f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af den tyske Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| REAGENTS | |||
| Acepromazine | Sanofi GmbH | anesthetic | |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | anesthetic |
| Ketamin | Pharma GmbH | anesthetic | |
| Fast Green | Fluka | 44715 | |
| Rimadyl | Pfizer | non-steroidal anti-inflammatory | |
| Braunoderm | Braun | 3887138 | povidone-iodine |
| Phosphate Buffer Saline PBS | Gibco | 14190 | |
| Temgesic (buprenorphine) | Essex Pharma | opioid analgesic | |
| Eye Ointment | Pan-Ophtal | 7136926 | |
| Xylazine | Bayer | ||
| EQUIPMENT | |||
| Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 | Medical Developments Australia | ACN 004 903 682 | |
| Capillary puller P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Compresstome | Precisionary Instr. | VF-300 | Vibratome-type device |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Electroporator | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY21EDIT | |
| Electrode 1 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY550-10 | Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam. |
| Electrode 2 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY700P4L | Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter |
| Fiberoptic cold light source | Leica | KL2500 LCD | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | GC120T-15 | 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D. |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | FST250 | |
| Heating pad | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Injection device | World Precision Instruments | Pneumatic Pico Pump PV820 | |
| Suture Thread Coated Vicryl | Ethicon | V4914 | Peritoneal Suture |
| Suture Thr. Supramid | Serag Wiessner | TO07171L | Skin Suture |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
- Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. 신경과학. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
- Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
- Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
- Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27 (2012).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
- Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
- Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
- Canteras, N. S., Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. . The Mouse Nervous System. , 539-562 (2011).
- Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).
- Altman, J., Bayer, S. A. The Development of the Rat Hypothalamus. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. 신경과학. 105, 7-17 (2001).
- Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
- Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
- Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
- Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
- Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4 (2012).
- Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
- Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O’Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
- Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).
- Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
- Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).
