В сочетании Анализы для мониторинга рефолдинг Белок в<em> Saccharomyces CEREVISIAE</em
Summary
В этой статье описывается использование люциферазы светляков-GFP слитого белка для расследования<em> В естественных условиях</em> Сворачивания белка в<em> Saccharomyces CEREVISIAE</em>. Используя этот реагент, повторную укладку модели тепловой денатурации белка может быть одновременно контролировали с помощью флуоресцентной микроскопии и ферментативного количественного анализа, чтобы исследовать роль компонентов proteostasis сети белок контроль качества.
Abstract
Proteostasis, определяемый как комбинированный процесс складывания белка / биогенезе, укладку / ремонта, и деградацию, это тонкий клеточный баланс, который должен быть сохранен, чтобы избежать вредных последствий 1. Внешних или внутренних факторов, которые разрушают этот баланс может привести к агрегации белка, токсичность и гибели клеток. У людей это является одним из основных факторов, способствующих симптомы, связанные с нейродегенеративных расстройств, таких как Гентингтона, Паркинсона и болезни Альцгеймера 10. Поэтому очень важно, что белки, участвующие в поддержании proteostasis быть идентифицированы с целью разработки методов лечения этих изнурительных болезней. Этой статье описываются методы для мониторинга в естественных условиях укладка белков в близком к реальному времени разрешение с помощью модели белка люциферазы светляков слит с зеленого флуоресцентного белка (GFP FFL-). FFL-GFP представляет собой уникальную модель химерных белков как FFL фрагмент чрезвычайно чувствительна к стресс-индуцированной мisfolding и агрегации, которая инактивирует фермент 12. Активность люциферазы контролируется с использованием ферментативного количественного анализа, а остаток GFP обеспечивает способ визуализации растворимый или агрегированные нулевой отметки с использованием автоматизированных микроскопии. Эти методы включают сочетание двух параллельных и технически независимых подхода для анализа и повторной укладки и функциональные реактивации фермента после стресса. Восстановление активности может быть непосредственно связано с кинетикой разукрупнения и повторного растворения, чтобы лучше понять, как белка контроль качества факторов, таких как белок шаперонами кооперируются для выполнения этих функций. Кроме того, ген делеции или мутации могут быть использованы для проверки вклады специфических белков или белковых субъединиц в этот процесс. В этой статье мы рассмотрим вклад белка disaggregase Hsp104 13, известного партнера с Hsp40/70/nucleotide фактором бирже (NEF) рефолдинга системы 5, с белком рефолдинга для проверки этого подхода.
Introduction
У людей нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона были связаны с неправильного сворачивания белка и агрегации 10. Клетки используют молекулярные шаперонами для предотвращения захвата кинетической клеточных белков в неактивной неправильно упакованных структур 6. Шаперонов участие в сложной сети взаимодействий в клетке, но это не совсем понял, как суммы этих взаимодействий способствует организменную proteostasis. Одним из основных шаперонов ответственны за большинство цитозольных складной белок 70 кДа белка теплового шока (Hsp70) семейство 19. Было показано, что в дрожжах потери Hsp70 уменьшается обеспечения возможности сгибать возникающий гетерологично выражены нулевой отметки и повторной укладки эндогенный протеин, орнитин transcarbamoylase, в 18 живом организме, 7. Умение анализировать складывающиеся с почти в реальном времени разрешение будет способствовать пониманию того, как дополнительные факторы сотовых продолжениеribute этому Hsp70-зависимый процесс. Кроме того, раскладной / рефолдинга реакции не может быть полностью зависимыми от этих белков способствует, поэтому анализы должны быть достаточно чувствительными, чтобы обнаруживать как крупные, так и небольшие изменения в кинетику и эффективность.
Disaggregase дрожжевой клетки, Hsp104, играет жизненно важную роль в ремонте агрегированных неправильно упакованных белков. Хотя Hsp104 гомологов были выявлены у грибов и растений, эта семья, кажется, отсутствуют в многоклеточные. Было высказано предположение, что другие шаперонов, такие как семейства Hsp110 выполнять некоторые из известных Hsp104 деятельности у млекопитающих 16. Hsp104 является AAA +, гексамерные белковый комплекс, который функционирует в дрожжах, чтобы реконструировать агрегаты белка, способствуя укладку и ремонт 13. Hsp104, вместе с дрожжами Hsp70, SSA1 и дрожжи Hsp40, Ydj1, необходимо для восстановления денатурированного нулевой отметки в дрожжевых клетках, 5, 8. Малый белок теплового шока, Hsp26, также было показано, что requiкрасный для Hsp104-опосредованной дезагрегацию FFL 2.
Лит состоит из двух доменов белок, который связывается субстрат люциферин в активном сайте и после конформационное изменение, которое требует АТФ и кислорода, декарбоксилирует подложки выпуска оксилюциферин, диоксида углерода (СО 2), аденозин монофосфат (АМФ) и 11 света, 9, 3. Коммерчески доступные нулевой отметки подложки, D-люциферин, приводит светового излучения между 550-570 нм, которые могут быть обнаружены с помощью фотометра 15. FFL исключительно чувствительна к денатурации химической или термической обработки и агрегатов на быстро разворачивается. Под воздействием температуры от 39-45 ° C FFL обратимо развернулась и инактивированные 12. В противоположность этому, GFP и его производные обладают высокой устойчивостью к разворачивания белка напряжений 14. Поэтому сплав этих двух белков позволяет нулевой отметки, чтобы функционировать в качестве экспериментального лабильный фрагмент, способный нацеливание функциональный GFP к внутриклеточным депозитов, которые могут быть визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии и население, и одного уровня ячейки. Применение ферментного анализа в полуавтоматическом многомодовых ридере в сочетании с автоматизированной микроскопии позволяет беспрецедентную одновременной оценки кинетики и выход рефолдинга реакций. Кроме того, легкий молекулярной генетики эукариот модели CEREVISIAE Saccharomyces позволяет и точное манипулирование сети управления качеством белка и возможность для открытия подходы к идентификации новых игроков способствует клеточной реакции стресса и proteostasis.
В этом исследовании дикого типа (WT) и Hsp104 удаления штаммы, экспрессирующие лит-GFP подлежат денатурации белка теплового шока. FFL-GFP рефолдинга контролируется через обе ферментного анализа и микроскопии в качестве прокси для считывания ремонт выразил протеомом за ходом времени восстановления. По сравнению с WT клетках, мы показываем йэлектронной Hsp104 удаления деформации ~ 60% менее эффективны при повторной укладки FFL-GFP, поддерживая предыдущие выводы создании Hsp104 роль в реактивации денатурированного FFL 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье модель белка FFL-GFP был использован, чтобы показать, что дрожжи disaggregase, Hsp104 способствует белка повторного растворения и ремонт. Ферментативный анализ и микроскопии дифференциально опрошенных состояния одного и того же белкового субстрата для определения повторной укладки…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Национального института здоровья (NIGMS-074696), чтобы КАМ и Американского общества микробиологии Роберт Д. Уоткинс аспирант исследовательский грант в Лигу Мы также благодарим Джон Гловер в Университете Торонто за предоставление нулевой отметки -GFP плазмиды источник.
Materials
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).
- Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
- Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. Mechanisms of protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).
- Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).
- Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).
- Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions. IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).
- Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
- Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values. Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).
- Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. The Spectral Distribution of Firefly Light. J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).
- Shorter, J. The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system. PLoS One. 6, e26319 (2011).
- Tkach, J. M., Glover, J. R. Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells. Traffic. 9, 39-56 (2008).
- Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants. Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).
- Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).
