のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em>サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em
Summary
この資料は、調査するホタルルシフェラーゼ-GFP融合タンパク質の使用を記載<em生体内で></emで>タンパク質のフォールディング<em>サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em>。モデル熱変性タンパク質のリフォールディング、この試薬を用いて、蛍光顕微鏡およびタンパク質の品質管理にproteostasisネットワークコンポーネントの役割を調査するために酵素アッセイによって同時に監視することができる。
Abstract
タンパク質の折り畳み/生物発生、リフォールディング/修復、および劣化の複合プロセスとして定義さProteostasisは、有害な結果1を回避するために維持されなければならない微妙な携帯バランスです。このバランスを崩壊させる外部または内部の要因は、タンパク質凝集、毒性および細胞死につながる可能性がある。ヒトでは、このようなハンチントン病、パーキンソン病、およびアルツハイマー病などの神経変性疾患10に関連した症状の主要な要因である。それはproteostasisの維持に関与するタンパク質は、これらの衰弱性疾患の治療法を開発するために識別されることが不可欠である。この記事は、緑色蛍光タンパク質（FFL-GFP）を融合したモデルタンパク質ホタルルシフェラーゼを用いた準リアルタイム分解能で生体内でタンパク質のフォールディングに監視するためのテクニックについて説明します。 FFL部分がストレス誘発mと非常に敏感であるようにFFL-GFPは、ユニークなモデルキメラタンパク質である酵素12を不活性化isfoldingと集約、。ルシフェラーゼ活性は、酵素アッセイを用いてモニターし、GFP部分は、自動顕微鏡を用いて可溶性または集約FFLを可視化する方法を提供する。これらの結合の方法は、リフォールディング、ストレス後の酵素の機能的再活性化の両方を分析するために二つの平行及び技術的に独立したアプローチを採用しています。活性回収を直接良好ようなシャペロンタンパク質などのタンパク質の品質管理因子がこれらの機能を実行するために協力する方法を理解するために分解し、再可溶化の動態と相関させることができる。また、遺伝子欠失又は突然変異がこのプロセスに特定のタンパク質またはタンパク質サブユニットの寄与をテストするために使用することができる。この記事では、このアプローチを検証するために、タンパク質リフォールディングに、システム5リフォールディングHsp40/70/nucleotide交換因子（NEF）と提携して知られているタンパク質disaggregase Hsp104の13の貢献を検討する。
Introduction
ヒトでは、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病を含む神経変性疾患は、タンパク質のミスフォールディングとアグリゲーション10にリンクされている。細胞は6ミスフォールド構造に不活性な細胞タンパク質の運動捕捉を防止する分子シャペロンを使用する。シャペロンは、細胞内の複雑な相互作用ネットワークに参加するが、それは完全にこれらの相互作用の合計は生物のproteostasisに寄与する方法を理解されていない。細胞質タンパク質フォールディングの大部分に関与する主要シャペロンの一つは、70 kDの熱ショックタンパク質（Hsp70の）ファミリ19である。なお、Hsp70は低下する酵母損失が初期の異種発現さFFLを折るし、 インビボ18、7内因性タンパク質、オルニチントランスカルバミラーゼを、リフォールディングしたりすることが示されている。ほぼリアルタイム分解能で折りたたみを分析する能力がCONT方法追加の細胞因子を理解することが容易になるこのHsp70の依存プロセスにribute。また、折り畳み/フォールディング反応はこれらの貢献のタンパク質に完全に依存しないかもしれないので、アッセイは、動態および効率の大小の変化の両方を検出するのに十分な感度でなければならない。
酵母細胞disaggregase、Hsp104のは、集約されたミスフォールドタンパク質の修復に重要な役割を果たしている。 Hsp104のホモログは、菌類や植物に同定されているが、この家族は後生動物に存在しないと表示されます。そのようなHsp110ファミリーのような他のシャペロンは、哺乳類16の既知のHsp104の一部のアクティビティを実行することが提案されている。 Hsp104のは、AAA +、六量タンパク質複合体である改造タンパク質凝集に酵母で機能する、リフォールディングと修復13に貢献。 Hsp70の酵母、SSA1、そして酵母HSP40、Ydj1とともにHsp104のは、酵母細胞5,8における変性FFLの回復のために必要とされる。小さな熱ショックタンパク質、HSP26も、requiであることが示されているFFL 2 Hsp104の媒介分解のための赤。
FFLは、脱炭酸、ルシフェリン、二酸化炭素（CO 2）、アデノシン一リン酸（AMP）と、光11を放出基板活性部位に基質ルシフェリンを結合し、ATPおよび酸素を必要とするコンフォメーション変化に続いて、二ドメインタンパク質である9,3。市販のFFL基板、D-ルシフェリン、照度計15を用いて検出することができる550から570 nmの光の発光をもたらす。 FFLは展開に応じ迅速に化学薬品や熱治療および集計から変性に絶妙に敏感です。 39-45との間の温度にさらされたとき°C FFLは、可逆的に不活化12折り畳まれる。対照的に、GFPおよびその誘導体は、応力14を展開タンパク質に対して非常に耐性がある。したがって、これら2つのタンパク質の融合は機能Gを標的とすることのできる実験的に不安定な部分として機能することができますFFL人口と単一細胞レベルの両方で、蛍光顕微鏡を用いて可視化することが可能な預金を細胞内FP。自動化された顕微鏡と相まって半自動マルチモードプレートリーダーにおける酵素アッセイのアプリケーションが動態と反応をフォールディングの収量前例のない同時評価を可能にします。また、モデル真核生物サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の容易な分子遺伝学は、正確なタンパク質の品質制御ネットワークの操作と細胞ストレス応答とproteostasisに貢献する新たな選手を識別するための発見ベースのアプローチのための機会の両方を可能にします。
本研究では、FFL-GFPを発現している野生型（WT）とHsp104の欠失株はタンパク質変性熱ショックを受けます。 FFL-GFPのリフォールディングは、回復時間にわたって表明プロテオームの修復のためのプロキシ読み出しとして酵素アッセイおよび顕微鏡の両方を通じて監視されています。 WT細胞と比較したとき、我々は番目を示す電子Hsp104の欠失株は変性FFL 2の再活性化にHsp104のための役割を確立する前の調査結果を支持し、FFL-GFPのリフォールディングで約60％の効率が悪くなります。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、モデルタンパク質FFL-GFPは、Hsp104のは、タンパク質の再可溶化および修復に貢献する酵母disaggregaseことを示すために使用されていました。酵素アッセイおよび顕微鏡差動的にリフォールディング効率及び収率を決定するために同一の基質タンパク質のステータスを尋問。酵素回復アッセイの結果は、非効率的なhsp104D変異株で最大の回復ですが、展開のストレスの初期の?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、KAM、我々はまた、FFLを提供するためにトロント大学のジョン·グローバーに感謝JLAに微生物ロバートD.ワトキンス大学院生研究フェローシップのアメリカの社会への国立衛生研究所（NIGMS-074696）からの助成金によってサポートされていましたプラスミド-GFPソース。
Materials
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).
- Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
- Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. Mechanisms of protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).
- Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).
- Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).
- Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions. IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).
- Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
- Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values. Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).
- Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. The Spectral Distribution of Firefly Light. J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).
- Shorter, J. The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system. PLoS One. 6, e26319 (2011).
- Tkach, J. M., Glover, J. R. Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells. Traffic. 9, 39-56 (2008).
- Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants. Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).
- Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).
