Målrettede Metabolomics fra biologiske kilder Brug Ultraperformance væskekromatografi-højopløsningsmassespektrometri (UPLC-HRMS)
Summary
Målrettede metabolomics giver en hypotese genererer øjebliksbillede af en metabolisk profil. Denne protokol vil demonstrere ekstraktion og analyse af metabolitter fra celler, serum eller væv. En række metabolitter undersøges ved hjælp af væske-væske fase ekstraktion, Microflow ultraperformance væskekromatografi / høj opløsning massespektrometri (UPLC-HRMS) koblet til differential analyse software.
Abstract
Her præsenterer vi en arbejdsproces til at analysere de metaboliske profiler til biologiske prøver af interesse, herunder, celler, serum eller væv. Prøven først adskilles i polære og ikke-polære fraktioner ved en væske-væske fase ekstraktion, og delvist oprenset for at lette downstream analyse. Både vandige (polære metabolitter) og organisk (ikke-polære metabolitter) faser af indledende ekstraktion behandles for at undersøge en bred vifte af metabolitter. Metabolitter adskilt af forskellige flydende kromatografiske metoder baseret på deres partition egenskaber. I denne metode, præsenterer vi Microflow ultra-performance (UP) LC-metoder, men protokollen er skalerbar til højere strømme og lavere tryk. Introduktion i massespektrometret kan være gennem enten generelle eller sammensatte optimerede kilde betingelser. Påvisning af en bred vifte af ioner udføres i fuld scanning i både positiv og negativ modus over et bredt m / z rækkevidde ved hjælp af høj opløsning på en nylig calibrated instrument. Label-fri differentieret analyse udføres på bioinformatik platforme. Anvendelser af denne fremgangsmåde omfatter metaboliseringsvej screening, biomarkør opdagelse og udvikling af lægemidler.
Introduction
Grund af de seneste teknologiske fremskridt inden for HRMS har målrettede, hypotese-genererende metabolomics tilgange blevet en realistisk tilgang til analyse af komplekse prøver. 1 massespektrometre stand 100.000 resolution lette rutinemæssig lave del per million (ppm) masse nøjagtighed blevet bredt tilgængelige fra flere leverandører. 2,3 Denne masse nøjagtighed tillader større specificitet og tillid i en indledende tildeling af analyt identitet, isotop mønstergenkendelse og adduct identifikation. 4. Når kombineret med en passende ekstraktionsprocedure og højtydende LC eller UPLC, komplekse blandinger kan analyseres med ekstra specificitet stammer fra fastholdelse tid data. 5. UPLC besidder større kromatografisk effektivitet og giver større følsomhed, opløsning og analyse tid på at gøre en større dækning af metabolomet muligt. 6. De resulterende store datasæt kan integreres i ethvertaf multiple differential analyse software og udvindes til nyttige mønstre eller individuelle analytter af interesse. 7,8,9,10,11 Formodede hits kan i første omgang identificeres ved hjælp af en kombination af peak detekteringsalgoritmer, præcis masse baseret kemiske formel forudsigelse, fragmentering forudsigelse og kemisk database søgning. Denne fremgangsmåde giver mulighed for prioritering af mål for tidskrævende fuldstændig strukturel identifikation eller af udvikling af mere følsomme og mere specifikke stabil isotopfortynding UPLC / udvalgte eller multipel reaktion overvågning / MS undersøgelser, som de nuværende guld standard metoder til kvantificering. 12.
De forskellige former for biologiske prøver har ført til optimering af udvinding protokoller for urin 13 celler 14, serum 15 eller væv 16. Denne protokol funktioner ekstraktioner for celler, serum og væv. I givet fald har kommentarer og yderligere henvisninger er medtaget for ændrintioner af proceduren for at løse inddragelse af stabile isotoper, eller om optagelse af særligt ustabile metabolitter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målrettede metabolomics tilbyder et kraftfuldt værktøj til at undersøge endogene eller miljøfremmede biotransformationer, eller indfange en metabolisk profil fra en prøve af interesse. Udgangen af teknikken skalaer med opløsning og følsomhed af den teknologi, der anvendes til at adskille og analysere prøverne, evnen til at håndtere de store genererede datasæt, og evnen til at udvinde datasættet for nyttige oplysninger (f.eks nøjagtige masse database søgning). For nylig har dette blevet fremmet af …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender støtte til NIH tilskud P30ES013508 og 5T32GM008076. Vi takker også Thermo Scientific for adgang til SIEVE 2.0 og Drs. Eugene Ciccimaro og Mark Sanders Thermo Scientific for nyttige drøftelser.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
- Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
- Makarov, A., Denisov, E., et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).
- Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics. Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data. BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).
- Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).
- Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization. Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).
- Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O’Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
- Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).
- Want, E. J., Wilson, I. D., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).
- Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Shaham, O., Slate, N. G., et al. A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).
- Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).
- Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol. Syst. Biol. 1, (2005).
- Cleveland, W. S., Devlin, S. J. Locally weighted regression – an approach to regression-analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).
- Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements. BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).
- Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).
- Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
- Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
- Smith, C. A., O’Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
- Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules. Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).
- Wishart, D. S., Knox, C., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
- Avery, M. J. Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).
