MBP tabanlı Etiketleme Stratejisi Mgm101 Rekombinasyon Protein hazırlanması
Summary
Maya mitokondriyal nükleoit proteini Mgm101, büyük oligomerik halkalar oluşturan bir Rad52 tipi rekombinasyon proteindir. Bir protokol, maltoz bağlanma proteini (MBP)-etiketleme katyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisi ile birlikte stratejisi kullanılarak çözülebilir rekombinant Mgm101 hazırlamak için tarif edilmektedir.
Abstract
MGM101 gen mitokondriyal DNA bakım rolü için 20 yıl önce tespit edilmiştir. Çeşitli gruplardan çalışmalar Mgm101 protein mitokondriyal DNA recombinational onarım dahil olduğunu ileri sürmüşlerdir. Son araştırmalar Mgm101 Rad52 tipi rekombinasyon protein aile ile ilgili olduğunu göstermiştir. Bu proteinler, büyük oligomerik halkaları oluşturmak ve homolog tek sarmallı DNA moleküllerinin tavlama teşvik eder. Bununla birlikte, Mgm101 karakterizasyonu, rekombinant proteinin üretiminde sekteye edilmiştir. Burada, rekombinant Mgm101 hazırlanması için bir güvenilir bir yöntem tarif edilmektedir. Maltoz bağlanma proteini (MBP)-etiketli Mgm101 olanlar, Escherichia coli içinde ifade edilir. Füzyon proteini, başlangıçta amiloz afinite kromatografisi ile saflaştırılır. Proteolitik bölünme ile serbest bırakıldıktan sonra, Mgm101 katyon değişim kromatografisi ile MBP ayrılır. Monodispers Mgm101 daha sonra elde edilirboyut dışlama kromatografisi ile. Bakteri kültürü litre başına Mgm101 bir ~ 0.87 mg verim rutin elde olabilir. Rekombinant DNA Mgm101 asgari kirlenme vardır. Hazırlanan numunelerin başarıyla Mgm101 biyokimyasal, yapısal ve tek bir parçacık resim analizleri için kullanılır. Bu protokol, aynı zamanda yanlış katlanmış ve bakteri hücreleri için toksik olabilir diğer büyük oligomerik DNA bağlayıcı proteinlerin hazırlanması için kullanılabilir.
Introduction
Homolog rekombinasyon çift iplikli sonları tamiri (DSBs) ve zincirler arası çapraz bağlar, ve çökmüş çoğaltma çatal 1 DNA replikasyon reinitiation için önemlidir. Geleneksel homolog rekombinasyon, merkez reaksiyon Prokaryotlarda RecA ve RAD51 ve 1-3 ökaryotlarda Dmc1 da dahil olmak üzere, ATP-bağımlı rekombinaz tarafından katalize edilir. Bu rekombinaz dubleks DNA şablonları (Şekil 1, sol panel) 4-7 içinde homoloji arama ve iplikçik işgali başlatmak için gerekli olan ssDNA, üzerinde nükleoprotein filamentler oluştururlar. Geleneksel programına ilave olarak, aynı zamanda, bir homolog rekombinasyon RecA/Rad51-independent şekilde (Şekil 1, sağ panel) içerisinde yer alabilir. Örneğin, maya Rad52 ve Rad59 proteinler doğrudan dsDNA tatili geriden kestirmeye tarafından sunulan tamamlayıcı ssDNA ipliklerini tavlama katalize edebilir. Şarkı olarak bilinen bu rekombinasyon işlemi,le iplikçik tavlama, genellikle homolog dsDNA şablonları ile eşleştirme anlamına gelmez. Tavlama işleminden sonra, heterolog kuyrukları exonucleases ile çıkarılır ve çentikler genom süreklilik 8-10 geri ligate edilir. Tek tel çekme mekanizması ile tamir genellikle doğrudan tekrar bölgeleri arasında genom dizilerinin silinmesi eşlik eder.
Rad52 bakteriyofajlar 11 arasında yaygın olan rekombinasyon proteinlerin çeşitli bir grup aittir. Bu proteinler aynı zamanda, homolog tek sarmallı DNA moleküllerinin tavlama teşvik etmedeki aktiviteleri göre, tek tel çekme Proteinleri (SSAPs) olarak bilinir. En iyi karakterize bakteriyofaj SSAPs Redβ ve laktokokkal faj ul36 gelen profajının rac ve Sak protein bakteriyofajlar λ ve P22, rect gelen Erf vardır. Benzerlik neredeyse undetect rağmen SSAPs yapısal olarak, tipik bir β-β-β-α kat ile karakterize edilirbirincil dizileri mümkün. 10 Onlar tüm form büyük homo-oligomerik halkaları – in vitro 12-14 14 kat simetri. Bu özelliği yüksek mertebeden yapısal organizasyonun fonksiyonel etkileri iyi anlaşılmış değildir.
Biz mitokondriyal genom homolog rekombinasyon mekanizması anlamada ilgilendi. Daha önce, Saccharomyces cerevisiae 15 mtDNA bakımı için gerekli olan MGM101 gen tanımlanmıştır. MGM101 sonradan mitokondriyal nukleoidler ile ilişkili olduğu bulunmuştur ve DNA'ya zarar veren ajanlara mtDNA tolerans 16 için gereklidir. Ancak, Mgm101 çalışma rekombinant Mgm101 üretmek için zorluk tarafından son on yılda geri gerçekleştirildi. Biz son zamanlarda E. büyük miktarlarda çözünür Mgm101 üretiminde başardı MBP-füzyon strateji kullanarak coli. Bu bize Mgm101 hisse göstermek sağladıprotein 17,18 en Rad52 aile ile biyokimyasal ve yapısal benzerlikler. Bu raporda, üç aşamalı bir saflaştırma prosedürü homojen Mgm101for biyokimyasal ve yapısal analizleri (Şekil 2) üretir, tarif edilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
E. bir istikrarlı, yerli rekombinant Mgm101 proteini üretmek için bir meydan okuma olmuştur bakteri hücrelerinin kendi çözünürlükten muhtemelen nedeniyle coli. Bu raporda, MBP-füzyon stratejisi protein oldukça yüksek bir seviyede ifade edilmesini sağlar olduğunu göstermektedir. Negatif boyama transmisyon elektron mikroskopisi ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak, daha önce MBP-füzyon proteininin in vitro 18 üniform oligomerleri oluşturur göst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz transmisyon elektron mikroskobu için yardım Stephan Wilkens teşekkür ederim. Bu çalışma Sağlık Hibe R01AG023731 Ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Expression vector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatography column | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade column | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
References
- San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
- Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
- Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
- Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
- Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
- Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
- Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
- Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. 유전학. 153, 1117-1130 (1999).
- Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
- Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
- Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
- Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
- Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
- Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
- Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
- Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
- Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
- Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
- Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
- Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
- Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).
