Summary
Multi-Bildgebung ist ein wertvoller Ansatz zur Untersuchung bakterieller Besiedlung in kleinen Tiermodellen. Dieses Protokoll beschreibt Infektion von Mäusen mit Biolumineszenz
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte, um in Längsrichtung Überwachung eines Biolumineszenz bakterielle Infektion mit Composite 3D diffuses Licht Bildgebung Tomographie mit integriertem μCT (DLIT-μCT) und die anschließende Verwendung dieser Daten einen vierdimensionalen (4D) Film der Infektion Zyklus zu erzeugen. Um die Infektion 4D-Filme zu entwickeln und die DLIT-μCT Bildgebung für bakterielle Infektion Studien unter Verwendung eines IVIS Spectrum CT validieren, haben wir eine Infektion mit C. Biolumineszenz rodentium, die selbst limitierende Kolitis bei Mäusen verursacht. In diesem Protokoll, skizzieren wir die Infektion von Mäusen mit Biolumineszenz C. rodentium und nicht-invasive Überwachung der Kolonisierung durch tägliche DLIT-μCT Bildgebung und bakterielle Aufzählung von Fäkalien für 8 Tage.
Die Verwendung des IVIS Spectrum CT eine nahtlose Co-Registrierung von optischen und μCT Scans mit einer einzigen Bildgebungsplattform. Die geringe Dosis μCT Modalität ermöglicht die Bildgebung von Mäusenzu mehreren Zeitpunkten während der Infektion mit detaillierten anatomischen Lokalisation der Biolumineszenz bakterielle Herde in 3D, ohne dass Artefakte aus der kumulativen Strahlung. Wichtig ist, bieten die 4D Filme von infizierten Mäusen eine leistungsstarke analytische Werkzeug, um bakterielle Besiedlung Dynamik in vivo zu überwachen.
Introduction
Kleine Tiermodellen, insbesondere solche Verwendung Mäusen, werden routinemäßig verwendet, um bakterielle Pathogenese zu untersuchen oder zu Interventionsstrategien gegen Infektionen, wie z. B. Antibiotika, Probiotika, Präbiotika und Impfstoffe 1-7 zu testen. Die wichtigsten experimentellen Positionsanzeigen von Kleintier-Infektionen sind Erreger Last, räumlichen und zeitlichen Lokalisierung der Infektion und Änderungen an der Immunantwort des infizierten Organismus. In vivo optische Bildgebung ist ein wertvolles Werkzeug für die Erforschung infektiöser Krankheiten und kann zur Überwachung eingesetzt werden mehrere experimentelle Auslesen durch die Verwendung von Reportergenen (Luciferase, fluoreszierenden Proteinen, beta-Lactamase, etc), fluoreszierende Farbstoffe, Nanopartikel oder chemilumineszierende Sonden an ein Protein, biologische Verfahren oder Mikroorganismus 6 ausgerichtet.
Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) ein optisches bildgebendes Verfahren verwendet, um die Kolonisierung von kleinen Tieren wie Ratten und Mäusen zu überwachen, die durch pathogene Bakria 3,6,8,9. Die Mäuse werden mit rekombinanten Bakterien exprimieren eine Luciferase, wie die lux-Operon aus Photorhabdus CDABE luminescens. Diese Bakterien können dann durch die Lichterzeugung mit einer CCD in vivo bildgebenden Systems 3,6,9 Basis detektiert werden infiziert. Wichtig ist, dass nur metabolisch aktiven Mikroorganismen Biolumineszenz (BL), was bedeutet, einzig gangbare Bakterienzellen durch diese Methodik 10,11 detektiert werden. Mit 2D BLI, die Lage des BL Quelle von der Oberfläche des Tieres in dem das Signal ausgesendet 8 geschlossen wird. Die genaue anatomische Lokalisierung der BL Foci in vivo durch die ex vivo-Analyse von Organen 3,6,9 dagegen bestimmt werden kann zusammengesetzten 3D diffuse Licht Bildgebung Tomographie (DLIT) verwendet, um eine quantitative 3D-Rekonstruktion des BL zusammenstellt Quelle 12. DLIT wird durch das Sammeln von BL aufgenommenen Bilder unter Verwendung von definierten engen Bandpass-Filter und optischeanschließend Eingabe in eine diffuse optische Tomographie 3D-Rekonstruktion Algorithmus 1,7,12,13.
Derzeit ist multi-Bildgebung die einzige Methodik für echte, nicht invasive anatomische Lokalisierung der Biolumineszenz-Foci in vivo, ohne die Notwendigkeit für ex vivo-Analyse erhalten. Kürzlich haben wir eine Kombination von DLIT mit μCT Bildgebung Zusammenarbeit registriert Citrobacter rodentium (C. rodentium) Kolonisation Dynamik nach prophylaktischen Behandlung mit einem probiotischen Bakterium 7 zu bewerten. C. rodentium ist ein Maus-spezifischen magensaftresistente Erreger verwendet, um Modell Infektion mit enteropathogenen und enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. rodentium Infektion verursacht ulcerosa, in der Regel mit leichten Gewichtsverlust, Durchfall, polarisierte Th1 Immunantwort und verschiedene pathologische Veränderungen, einschließlich Kolon Kryptenhyperplasie und Befestigen und zurückhaltend Läsion formati verbundenon 14. Zusätzlich zu diesem, C. rodentium Pathogenese wurde gründlich studiert mit BLI und seine Besiedlung Dynamik in C57BL/6J-Mäusen sind gut dokumentiert, so dass dieses Bakterium ein ideales Modell Mikroorganismus für die Verwendung mit Multi-Bildgebung 3,4,7.
Dieses Protokoll ist das erste, eine Methodik zur integrierten DLIT-μCT Bildgebung von einer bakteriellen Infektion mit einem einzigen multimodalen Imaging-Plattform, die IVIS Spectrum CT, und die Erzeugung eines 4D-Film zeigt die wahre Dynamik dieser Infektion nicht-invasiv zu skizzieren.
Protocol
1. Mäuse Vorbereitung
- Kaufen oder züchten genug 18-20 g C57BL/6J-Mäusen für die Studie erforderlich.
- Wenn Mäuse von einem externen Lieferanten gekauft werden, nach dem Transport auf der Anlage, zu gewöhnen Mäuse für 1 Woche auf autoklavierte Nahrung und Wasser, um die Darmflora zu stabilisieren.
- Wiegen, Ohr Kerbe, und trennen Sie die erforderliche Anzahl von Mäusen pro Käfig.
- Der Tag vor der Infektion, bevor Sie irgendwelche Anästhesie, überprüfen Sie, dass es ausreichend Sauerstoff und Isofluran für die Dauer des Verfahrens. Falls erforderlich, fügen Sie mehr Isofluoran oder ersetzen Sie die Sauerstoffflasche. Anschließend überprüfen das Gewicht der Narkose Aasfresser, wenn sie mehr als 50 g seit ihrem ersten Einsatz hat, zu entsorgen und ersetzen mit frischen Aasfresser.
- Betäuben Mäuse mit 3% Isofluran in der XGI-8 Anästhesie System und enthaaren mit VEET für 7 min.
- Hinweise:
- Gründliche Enthaarung ist wichtig, vor allem inschwarze Mäuse als Melanin im Fell deutlich dämpft das Signal bioluminescent 3,15.
- Enthaarung von Mäusen dauert in der Regel 8-10 Tage vor dem Fell beginnt wieder zu wachsen. Um 4D Multimodalität Bildgebung über längere Zeiträume durchzuführen, enthaaren Mäusen, wenn erforderlich, so dass der Bereich von Interesse nackt für den Imaging-Sitzungen ist.
- Die Mäuse werden in einem Biosafety Level 2 (BSL-2) Eindämmung Anlage untergebracht.
2. Bakterielle Zellpräparation
- Planen Sie genug Luria Burtani Brühe und Agar-Platten mit Kanamycin [50 ug ml -1] ergänzt für das Studium und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung erforderlich.
- Am Tag vor der Infektion auftauen eine cryovial von C. rodentium Stamm ICC180 und sofort eine cryobead bis 15 ml LB-Medium mit Kanamycin [50 ug ml -1] und Kultur über Nacht bei 220 rpm, 37 ° C ergänzt Als Kontrolle für mittlere Verunreinigungen, bereiten eine zusätzlicheungeimpften 15 ml LB-Medium mit Kanamycin [50 ug ml -1] und Kultur bei 220 rpm, 37 ° C ergänzt
- Am nächsten Morgen (~ 16 Stunden), überprüfen Sie die Steuerung für mittlere Trübung als ein Zeichen von Bakterienwachstum. Wenn die Steuerung ist klar, übertragen Sie die ICC180 Kultur zu einem Falcon-Röhrchen und zentrifugieren bei 4.000 Umdrehungen pro Minute. Anschließend waschen Sie die bakterielle Pellet in PBS. Dann in 1,5 ml PBS (1/10 des ursprünglichen Volumens von LB mit Kanamycin ergänzt) resuspendieren und gründlich mischen, um die bakterielle Inokulum erstellen.
- Um sicherzustellen, dass ICC180 ordnungsgemäß und kultiviert ist bioluminescent vor der Infektion der Mäuse, Bild des Inokulums im IVIS Spectrum CT mit BLI und die Automatik-Einstellung in der Living Bild 4.3.1 Assistenten wie zuvor beschrieben 1.
Hinweis:- Stamm ICC180 ist ein Derivat der Biolumineszenz Wildtyp C. rodentium ICC169 2. Dieser Bakterienstamm hat das lux-Operon CDABE einschließlich einer Kanamycin Resistenzgens in einer pseudogene von xylE in das Chromosom 2 eingesetzt.
- Führen Sie alle bakteriellen Kultivierung Verwendung der üblichen aseptischen Techniken und bei Bedarf entweder kaufen sterile Verbrauchsmaterial / Reagenzien oder Autoklaven vor der Verwendung.
- In Schritt 2.4 kann die Biolumineszenz Messwert (p / s / cm 2 / sr) verwendet, um bakterielle Zahlen vor der Infektion der Maus zu schätzen.
3. Infektion von Mäusen mit Bioluminescent C. rodentium und Beurteilung der bakteriellen Besiedelung
- Vor der Infektion, überprüfen Sie, dass es ausreichend Sauerstoff und Isofluran für die Dauer des Verfahrens. Falls erforderlich, fügen Sie mehr Isofluoran oder ersetzen Sie die Sauerstoffflasche. Anschließend überprüfen das Gewicht der Narkose Aasfresser, wenn sie mehr als 50 g seit ihrem ersten Einsatz hat, zu entsorgen und ersetzen mit frischen Aasfresser.
- Betäuben Mäuse mit 3% Isofluran mit einem XGI-8 Anästhesistensia-System, um humane Zurückhaltung geben.
- Mischen Sie die Bakterieninokulum gründlich und ziehen 0,2 ml (ca. 5 x 10 9 cfu ICC180) in die Spritze.
- Entfernen Mäuse aus der Narkose System ein zu einer Zeit und scruff sie an, indem Sie die Haut hinter dem Nacken mit dem Daumen und Zeigefinger.
- Drücken Sie die Magensonde Nadel gegen das Dach der Mund, über die Zunge und die Speiseröhre und injizieren Sie die Bakterieninokulum in den Magen.
- Nach orale Gabe der Mäuse, überwachen ihre Gangart und Atmung für Anzeichen von Leiden, die ein Zeichen dafür, dass die bakterielle Inokulum in die Lunge abgegeben worden sein kann. Euthanize keine Mäuse, die in der Lunge wurden geimpft.
- Gavage infizierten Mäuse mit 200 ul PBS als Kontrolle über das Fahrzeug wie in den Schritten 3.1-3.6 beschrieben.
- Um zu bestätigen, dass die orale Gabe korrekt durchgeführt wurde, mit Bild-infizierten und Mock infizierten Mäusen in der IVIS Spectrum CT BLI und die Automatik-Einstellung im WohnzimmerBild 4.3.1 Assistenten wie zuvor beschrieben 1.
- Bestimmen Sie die Anzahl lebensfähiger Bakterien im Inokulum durch serielle Verdünnung in PBS und Spotting in dreifacher Ausfertigung auf LB-Agar mit Kanamycin ergänzt [50 ug ml -1].
- Berechnen Sie die Anzahl der ICC180 KBE / ml, indem sie eine Verdünnung, wo es etwa 5-50 Kolonien und zählen die Anzahl der Kolonien von jedem Ort in dieser Verdünnung und notieren Sie die Verdünnung, dass die Kolonien auf gezählt. Anschließend berechnet die mittlere Anzahl der KBE (aus den drei Spots) und multiplizieren diesen Wert mit dem Verdünnungsfaktor 50 (jeder Punkt ist 20 ul der ursprünglichen Probe von 1 ml) und der Verdünnung die Kolonien auf gezählt wurden, was KBE / ml.
- Überwachen Kolonisierung der Mäuse täglich durch das Sammeln von Exkrementen von jeder Maus in einen vorher gewogenen Eppendorf-Röhrchen (gewogen auf einer feinen Balance) und verdünnt 1/10 in PBS bezogen auf das Gewicht der Probe (0,1 g ml -1).
- Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Bakterien indie Fäkalien durch serielle Verdünnung in PBS und Spotting in dreifacher Ausfertigung auf LB-Agar mit Kanamycin ergänzt [50 ug ml -1].
- Berechnen der Anzahl der lebensfähigen Bakterien pro Gramm Kot durch folgenden Schritt 3.9, multiplizieren die Zahl der cfu / ml von der fäkalen Verdünnungsfaktor in PBS (Schritt 3.10) von 0,1 g ml -1 bis cfu / g zu ergeben.
- Um festzustellen, dass Mäuse, die mit einem reinen ICC180 Kultur beimpft und dass alle Kolonien Biolumineszenz. Nehmen Sie die Agar-Platten aus Schritt 3.8, beurteilen die bakterielle Koloniemorphologie entweder mit dem Auge oder wählen Sie eine repräsentative Kolonie von der Platte und Analyse mittels Lichtmikroskopie. Falls erforderlich, können Bakterien-Nachweis von spezifischen Stamm Kolonie-PCR durchgeführt, um die Reinheit der Kultur zu beurteilen. Anschließend Bild die Platten in der IVIS Spectrum CT mit BLI wie beschrieben in Schritt 3.7 und überprüfen, dass 100% der Kolonien auf der Platte Biolumineszenz sind.
Hinweise:- In Schritt 3.4, beim Einsetzen der SondennadelWenn Sie glauben, Widerstand nicht mit Gewalt die Magensonde Nadel, da dies bewirkt, dass der Impfstoff in die Lunge gehen. Stattdessen setzen Sie die Nadel und sanft wieder versuchen.
- Step 3.1 ist optional und Mäuse kann oral zwangsernährt ohne Narkose abhängig von den Instituten Tierschutz Politik.
- Hocker müssen ausgefüllt werden, dass sie den Tag gesammelt werden, überzogen. C. rodentium wird wachsen, auch wenn bei 4 ° C über Nacht in PBS belassen und wird die Quantifizierung der KBE / g Stuhl verursachen falsch zu sein.
4. Täglich Composite-3D Diffuse Licht Imaging-Tomographie mit μCT Imaging (DLIT-μCT) infizierter Mäuse
Tierschutz Überlegungen: DLIT-μCT beinhaltet DLIT optische Bildgebung mit einer schnellen, niedrige Strahlendosis μCT Scan (~ 23 mGy für zwei Maus-Scan, ~ 53 mGy für eine einzelne Maus-Scan) eines immobilisierten Tieres integriert. Diese Dosis akkumuliert mit jedem Imaging-Sitzung, so ist das Ziel halten die Dosis so low wie möglich (und immer weit unter dem LD 50/30), während immer noch leiste die Studie. In einigen Fällen, wenn es keine Anzeichen für eine Infektion in einem herkömmlichen BLI Scan von Mäusen kann die μCT Scan vermieden werden, um weiter zu minimieren Dosis. Obwohl Dosis so niedrig wie möglich gehalten wird, in längeren Studien, ob es eine Besorgnis über Strahlung, werden die Mäuse bei den ersten Anzeichen von schädlichen Symptome oder am Ende des μCT Bildaufnahmeperiode getötet werden.
- Vor Bildgebung, initialisieren Sie die IVIS Spectrum CT und überprüfen, ob die X-ray Sicherheitskette arbeiten und dass die erwärmte Phase ist bei der richtigen Temperatur (37 ° C) für die Bildgebung. Anschließend überprüfen Sie die Höhe der isoflourane in der Narkose und dem Gewicht der Narkose Aasfresser. Falls erforderlich, fügen Sie mehr Isofluoran und wenn die Aasfresser mehr als 50 g seit ihrem ersten Einsatz gewonnen haben, zu entsorgen und ersetzen mit frischen Aasfresser.
- Richten Sie das Spectrum CT, so dass die Bildparameter, dassführen Sie das automatische Belichtung Feature in lebendiges Bild 4.3.1 sind für die Bildgebung bakterielle Luciferase optimiert. Wählen Sie Bearbeiten> Voreinstellungen> Erwerb und Auto Exposure Fenster. Dann wählen Sie> Bereich Werte> Exp. Zeit (Sekunden) und den> max. bis 300s. Schließlich wählen> Ziel Count (Minimum)> Leuchtziffern und auf 10.000 zählt.
- Legen Sie die Imaging-Plattform eine Maus in die Spectrum CT und lotrecht in die Anästhesie.
- Schalten Sie den X-ray Sicherheitsverriegelung und initialisieren die IVIS.
- Sobald die IVIS Spectrum CT initialisiert wurde, betäuben die Mäuse mit 3% Isofluran mit einem XGI-8 Anästhesie-System auf humane Zurückhaltung geben.
- Um zu bestimmen, ob es erforderlich ist, eine DLIT-μCT Scan Urbild die Mäuse mit BLI 1 wie zuvor beschrieben, in dem eine Maus Bildgebungsplattform durchzuführen. Wenn ein robustes Signal erhalten die Maus eignet sich für DLIT Bildgebung. Lassen Sie den narkotisierten Maus in der einen Maus Bildgebung platform nach der BLI Scan bereit für DLIT-μCT.
- Verwenden Sie die Imaging-Assistenten in der Living-Image Software 4.3.1 zu set-up der DLIT-μCT Scan. Die Imaging-Assistent ermittelt automatisch die FOV, Belichtungszeit, Blende und Binning für die DLIT und dem FOV, Belichtungszeit, Filter-Sets und Binning für die μCT Bildgebung um das beste Signal-Rausch-Verhältnis zu geben. Wenn der Imaging-Assistenten dazu aufgefordert, nur den 560, 580, 600 und 620 nm Emission Filter und wählen Sie das Maus μCT Scan. Dann klicken Sie auf> Erwerben, um die Abbildung zu starten.
- Bringen Sie den narkotisierten Maus in seinen Käfig nach der Bebilderung, entfernen Sie die Maus ein Imaging-Plattform aus dem Spectrum CT und desinfizieren mit 1% Tri-Gen. Falls nötig, wechseln Sie den Schaumstoff-Pad, dass die Maus auf, um das Risiko einer Kreuzkontamination zwischen Mäusen minimieren positioniert.
- Bild Mäusen täglich bis zu 8 Tage nach der Infektion (PI) mit DLIT-μCT, wie in den Schritten 4.1-4.8 beschrieben, um die Längs-Bilddaten erforderlich, um eine 4D mo machen generierenvie der Infektion.
Hinweis:- In Schritt 4.7, empfehlen wir die Verwendung der 560-620 nm Emission Filter auf Bild bakterielle Biolumineszenz. Obwohl die Spitze des bakteriellen Biolumineszenz etwa 485 nm, durch Gewebe Optik (die signifikante Dämpfung der blauen / grünen Photonen durch murine Gewebe), ist es wichtig, die orange / rote Photonen für 3D-Rekonstruktionen, wie sie die Berechnung des Signals Tiefe zu erleichtern .
- Die 'auto' Belichtungseinstellungen in lebenbild 4.3.1 für DLIT müssen angepasst werden, um die Menge der Photonen eingefangen und die maximale Aufnahmezeit für jeden Filter-Set verwendet optimieren.
- Es ist nur notwendig zur Durchführung der BLI pre-Bildgebung beschrieben in Schritt 4.6, wenn die Forscher nicht sicher, ob es ein nachweisbares Signal Biolumineszenz, zum Beispiel bei der Verwendung einer neuen Infektion Modell.
5. 3D-Rekonstruktion von DLIT-μCT Imaging Daten
- Offene Wohnzimmer Bild Software 4.3.1 und wählen Sie>; Durchsuchen und öffnen Sie den Ordner mit den DLIT-μCT Dateien.
- Öffnen Sie die Datei DLIT-μCT in der Living Image Browser, zum Beispiel C. rodentium Tag 1 PI, indem Sie auf Laden.
- In der Tool-Palette wählen> Surface Topographie> Nude Maus, stellen Sie die Schwelle, und klicken Sie dann auf> Generate Surface. Wenn die Oberfläche Wiederaufbau erfolgreich ist eine Oberfläche Umriss wird in der 3D-Ansicht angezeigt werden.
- Um das gerenderte μCT Scan in der 3D-Ansicht Fenster zu sehen, blenden Sie die Oberfläche Umriss (Klicken Sie auf> optische 3D-Tools und unselect> Display Oberfläche Object), oder verringern Sie die Oberfläche Opazität (Klicken Sie auf> optische 3D-Tools und stellen Sie die> Deckkraftregler bar).
- Um detaillierte anatomische Lokalisation des 3D DLIT Wiederaufbau ist es notwendig, die volumetrische 3D-Daten (μCT Scan), so dass nur die Maus Skelett sichtbar ist und dass es einen optimalen Kontrast zu verändern bereitzustellen. Klicken Sie auf> 3D-Werkzeuge und Multimodalität select> Logarithmische Histogramm, Gradient Beleuchtung, Qualität und Denoise. Schließlich, stellen Sie die Histogramm-Regler nach rechts, und beobachten Sie die 3D volumetrischen Daten Kontrast ändern. Halten Sie die Anpassung der Daten, bis nur noch die Knochen gut sichtbar sind. Falls gewünscht, ändern Sie die Farbe für den Transfer Function Points auf dem Histogramm.
- Weiter select> DLIT 3D-Rekonstruktion in der Tool-Palette und stellen Sie sicher, dass nur die 560, 580, 600 und 620 nm-Filter-Sets, die für die Bildgebung bakterielle Luciferase in vivo erforderlich sind, ausgewählt wurden. Klicken Sie auf> Start. Die Data Preview Menü Fenster wird nun angezeigt, welche die spektral gefiltert BL Signale von der Maus, die in 2D abgebildet wurde. Diese Signale werden von der Software automatisch Schwellenwert, kann aber manuell eingestellt werden, wenn erforderlich, mit Registerkarten am unteren Rand des Menüs. Der Schwellwert bestimmt die minimale Datenintensität (dargestellt als Prozent der maximalen Signals in dem Bild), die als Daten in die Rekonstruktion aufgenommen werden.
- Weiter select> DLIT 3D-Rekonstruktion in der Tool-Palette und prüfen Sie, dass die optischen Eigenschaften für den Wiederaufbau verwendet DLIT korrekt sind. Wählen Sie> Registerkarte Eigenschaften und stellen Sie sicher, dass die Einstellungen für Tissue Immobilien Mausgewebe gesetzt ist, wird Quelle Spectrum zu den Bakterien eingestellt.
- Klicken Sie auf>, um den Neuaufbau DLIT Rekonstruktion durchzuführen.
- Um die DLIT-μCT 3D-Film Klick erzeugen> Tools> 3D-Animation und wählen Sie> Preset Animations> CCW Y-Achse und> Gesamtdauer> 10 sec (25 Bilder pro Sekunde). Sobald die Einstellungen für die 3D-Animation sind korrekt, drücken Sie> und speichert die DLIT-μCT 3D-Rekonstruktionen als. AVI-Dateien mit dem Experiment, Gruppe und Zeitpunkt in einem separaten Ordner beschriftet.
Hinweis:- Es ist wichtig, bei der Durchführung von 3D-Rekonstruktionen von DLIT-μCT Daten an einen PC mit Wohnzimmer Bild 4.3.1 und Service-Paket 1 installiert ist und dass der PC über eine Grafikkarte geeignet für den Betrieb der Multi-Modalität Imaging-Software zu verwenden. Thwird Software kann heruntergeladen werden, und GPU-Spezifikationen sind in den Release Notes (enthalten http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm ).
- Wenn die DLIT-μCT 3D-Rekonstruktionen rückwärts erscheinen nach dem Speichern, ist Ihr Computer eine alte Version seiner Grafiktreiber und dies kann durch Einspielen eines Updates von der Hersteller Website behoben werden.
- In Schritt 5, präsentieren wir unsere bevorzugten Einstellungen für Erzeugung von 3D-DLIT μCT Rekonstruktionen. Es gibt jedoch mehrere Punkte in der 3D-Rekonstruktionen bei dem die Parameter, die in diesem Protokoll diskutiert geändert werden können. Für eine umfassende Anleitung zur 3D-Rekonstruktionen mit Living Bild 4.3.1 entnehmen Sie bitte der Hersteller Betriebsanleitung.
- Es ist wichtig, um die 3D-Rekonstruktionen mit identischen Einstellungen in der Multimodalität Imaging-Tool, so dass sie vergleichbar sind zu schaffen. Zusätzlich zudies, bei der Erstellung der DLIT-μCT 3D-Rekonstruktionen, ist es wichtig, um die Videos mit der gleichen Anzahl von Bildern pro Sekunde und die Gesamtlänge (Länge), sonst der Zeitpunkt der 4D-Video ist nicht homogen zu machen.
6. Generierung einer 4D-Film von C. rodentium Infektion
- Eindeutig zu kennzeichnen alle DLIT-μCT 3D-Rekonstruktionen mit der richtigen Experiment, Zeitpunkt und Gruppe in einer leicht zugänglichen Ordner.
- Erstellen Sie eine neue Datei in Windows Live Movie Maker und legen Sie die DLIT-μCT Rekonstruktionen in chronologischer Reihenfolge von Tag 1 PI mit der Registerkarte Tools aus dem Ordner in Schritt 6.1 vorbereitet.
- Hinzufügen von Beschriftungen zu Beginn jedes Video beschreibt den Zeitpunkt, zum Beispiel Tag 1 PI durch Auswahl der entsprechenden DLIT-μCT Video und wählen Sie dann Home> Bildunterschrift hinzufügen. Ein Textfeld erscheint auf dem Bildschirm, wo die entsprechende Legende aufgenommen. Stellen Sie die Schriftgröße, Stil, Farbe und Ausrichtung des alsired Verwendung identischer Registerkarten, um Microsoft Word in der Software-Symbolleiste. Schließlich bewegen die Beschriftung in der oberen linken Ecke des Videos.
- Wiederholen Sie Schritt 7.3 für alle DLIT-μCT Videos.
- Fügen Sie eine Titelseite, zum Beispiel C. rodentium Infektion 1-8 Tage durch Klick auf Home> Titel. Ein Textfeld erscheint auf dem Bildschirm, wo die entsprechenden Titel zu einer leeren Folie hinzugefügt wird. Stellen Sie die Schriftgröße, Stil, Farbe und Ausrichtung wie gewünscht mit identischen Registerkarten, um Microsoft Word in der Software-Symbolleiste.
- Speichern Sie das Projekt als Movie Maker-Projekt * mmp in einem entsprechenden Ordner mit dem Titel des Films. Dieser Schritt ist wichtig, wenn Sie den Film ändern wollen.
- Speichern Sie den Film als. Wmv-Datei. Klicken Filmemacher-Menü> Speichern Film> für Computer.
- Konvertieren Sie die Movie Maker-Datei mit einem Datei-Konverter auf. Avi oder einem anderen geeigneten Dateityp mit Ihrem Computer kompatibel.
Hinweise:- Es wird empfohlen, dass die 4D-Filmewerden auf einem PC mit Windows Live Movie Maker installiert (erzeugt http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker ) und eine gute Multi-Media-Programm der Lage zu spielen. wmv oder. avi Dateien Arten.
Representative Results
Infektion von C57BL/6J-Mäusen mit 5 x 10 9 cfu C. rodentium ist ein gut beschriebenen bakteriellen Infektion Modell und führt zu einem selbst limitierende Magen-Darm-Infektion, die Spitzen zwischen 6-8 Tage nach der Infektion und dauert zwischen 3 bis 4 Wochen 2,14. Die Infektion mit dem Darmlumen durch die murine Immunsystem beschränkt und als Folge, Bakterien kontinuierlich in den Kot zu vergießen. Colonization von Mäusen durch C. rodentium kann nicht-invasiv durch direkte bakterielle Aufzählung von Kot oder Biolumineszenz-Bildgebung 2,3 überwacht werden.
Dieses Manuskript beschreibt ein optimiertes Protokoll für die Durchführung 3D-und 4D Bildgebung Multimodalität von C. rodentium innerhalb Mäuse bakterielle Belastung und Lokalisierung während der Infektion zu überwachen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt sind, zeigen die Steuerelemente, die für eine erfolgreiche 4D-Bildgebung erforderlich sind. Vor der Infektion von Mäusen, ist es wichtig zu bestimmenMine dass die bakterielle Inokulum verwendet Biolumineszenz (1A) ist, und dass im Anschluss an die orale Gabe einer Maus mit Biolumineszenz C. rodentium, dass das Signal in den Magen des Tieres und nicht in der Lunge (1B) 16 beobachtet werden kann.
Neben der Überwachung bakterielle Besiedlung mit Biolumineszenz-Bildgebung, ist es gute Praxis, Keimzahlen im Kot quantifizieren; die als eine indirekte Messung der bakteriellen Besiedlung des Magen-Darm-Schleimhaut verwendet Abbildung 2 zeigt den typischen bakteriellen Belastung im Kot von 8 C57BL6 / J gemacht. Mäuse, die mit ~ 5 x 10 9 cfu ICC180 infiziert wurden und überwacht für 8 Tage PI Colonization steigt von Tag 2 bis Tag PI 6-7, wo die Infektion Peaks bei ~ 5 x 10 10 KBE / g, was im Einklang mit früheren Berichten 2,3,17.
Um die Bedeutung der Evaluation betonenting die Ausbreitung der Infektion in einem einzigen Mausklick, 1b und 3 sowie Video 1 wurden aus dem gleichen Maus wurde nach C erzeugt rodentium Infektion, wie oben beschrieben. Täglich DLIT-μCT wurde verwendet, um die räumliche Verteilung der biolumineszenten Bakterien in dieser Maus zu bewerten, mit dem Skelett als anatomische Referenz. Abbildung 3 zeigt die DLIT-μCT Rekonstruktion eines C57BL/6J Maus mit ICC180 bei 3 Schlüssel Zeitpunkten PI infiziert Bei Tag 3 PI kleine bioluminescent Brennpunkte können im Dickdarm beobachtet werden, welche zeigen einen moderaten Anstieg des Biolumineszenz Intensität von Tag 5 PI mit wenig Veränderung in der räumlichen Verteilung. Am Tag 7 PI beobachteten wir einen signifikanten Anstieg der Biolumineszenz und die Biolumineszenz Brennpunkte Ausbreitung über den gesamten Dickdarm.
Video 1 ist eine Zusammenstellung von 3D-DLIT μCT Rekonstruktionen von 1-8 Tagen PI mit ICC180 und illustriert C.rodentium innerhalb des proximalen Gastrointestinaltrakt zwischen den Tagen 1-2 PI, die dem Doppelpunkt am Tag verteilt 3 PI Von 4-6 Tage PI die Keimzahlen in den Dickdarm bis Höchststand am Tag 7 PI wo die bakterielle Herde deckt den gesamten Dickdarm zu erweitern. Am Tag 8 PI nur zwei verschiedene bakterielle Herde sind in der proximalen und distalen Kolon. Die Fähigkeit, die volle 3D-Rekonstruktion zu jedem Zeitpunkt in chronologischer Reihenfolge anzuzeigen stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, um Host-Pathogen-Interaktionen zu analysieren und ist einfacher zu interpretieren als ein 3D noch aus dem gleichen Datenbestand.
Abbildung 1. 2D Biolumineszenz-Bildgebung von A) Bioluminescent C. rodentium ICC180 Inokulum und B) eine Maus nach orale Gabe mit 200 ul des Inokulums. Arrowhead (>) zeigt bioluminescent C. rodentium em> in den Magen.
Abbildung 2. C. rodentium Kolonisation Dynamik. Quantifizierung von C. rodentium koloniebildenden Einheiten von Kot für 8 Tage PI
Abbildung 3. Diffuses Licht Imaging-Tomographie-Scan μCT biolumineszenter C. rodentium Infektion von einer Maus am Tag 3, 5 und 7 PI Arrowhead (>) überwacht veranschaulicht Kolon Kolonisation. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv "target =" _blank "> Klicken Sie hier, um Video anzusehen. 4D-Film von C. rodentium Infektion von einer Maus von 1-8 Tagen PI überwacht
Discussion
Die 4D-Film von bakteriellen Infektionen bietet ein nützliches Werkzeug zur Visualisierung und Interpretation großer Mengen von Multi-Bildgebung Daten schnell und einfach. Diese Technik erleichtert die detaillierte Analyse, wie eine Infektion breitet sich durch eine individuelle Maus und können verwendet werden, um zu untersuchen, wie Deletion von Host oder bakterielle Gene oder insbesondere Interventionsstrategien Wirkung Keimbelastung, Verteilung und Lokalisierung in einer longitudinalen Studie 7. Diese Videos auch nützliche Lehrmittel und ein Mittel zur Verbreitung von Informationen an die Öffentlichkeit.
Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll, das die Qualität der Daten aus DLIT-μCT Bildgebung und die Fähigkeit, ein 4D Video der Infektion kompilieren erhalten beeinträchtigen könnten. Der wichtigste Teil dieses Protokolls ist die erfolgreiche und homogene Infektion von Mäusen mit C. rodentium. Es ist wichtig, dass die Mäuse für die Studie verwendet zwischen 18-20 g sind, und dass die Bakrial Impfkulturen werden frisch zubereitet und ca. 5 x 10 9 KBE, wie zuvor beschrieben, 2,3. Vor Infektion der Mäuse ist es wichtig zu überprüfen, dass der Impfstoff mit dem Biolumineszenz Spectrum CT und einmal das Inokulum hergestellt worden ist, muss sie kontinuierlich homogenisiert werden, bevor jede Maus ist eine Sonde, um sicherzustellen, dass die Mäuse ähnlich infektiösen Dosen erhalten. Die DLIT-μCT Bildgebung von Mäusen wurde optimiert, so dass die automatische Belichtung Funktion im lebenden Bild 4.3.1 Software ermittelt automatisch die optimalen Bildparameter für das Signal weit über dem Lärm. Allerdings stützt sich die automatische Belichtung Funktion auf benutzerdefinierten Einstellungen und Parameter, die modifiziert werden, wie in dem Verfahren beschrieben werden müssen. Gelingt dies nicht, wird in schlechten Bilder mit einer geringen Anzahl von Photonen gesammelt, die nicht in einem offensichtlichen Fortschreiten der Infektion führen, wie das Spektrum der CT Werkseinstellungen für Belichtungsautomatik für die Bildgebung Tumore exprimieren programmiert führenGlühwürmchenluciferase. Renovationen durchgeführt mit 560-620 nm geben die beste Übereinstimmung zwischen simulierten und gemessenen Daten, und daher sind die zuverlässigere Daten zu enthalten in der Rekonstruktion.
Eine Beschränkung auf die Verwendung von DLIT-μCT ist, dass ionisierende Strahlung aus der μCT Scan bewirkt subletale Strahlenschäden, die kumulativ über einer longitudinalen Studie 18 ist. Sub-tödliche Strahlung können zu einer Schwächung der Immunreaktion, DNA-Schäden verursachen, und die Apoptose in den inneren Organen 19. Letztlich kann kumulative subletale Strahlenschäden zum Tod führen, wenn die LD 50/30 für ionisierende Strahlung überschritten wird, die zwischen 5-7 Gy in Abhängigkeit von der Maus-Stamm und Alter der Mäuse verwendet 18,20,21. Obwohl einige der molekularen Schäden durch ionisierende Strahlung kann heilen, da das übergeordnete Prinzip ist Dosis vorsichtiger Einschätzung wird dies in der Regel nicht für die in der Studie Planung berücksichtigt. Stattdessen ist es das Ziel, so weit bel bleibenow diese Grenzen wie möglich, während noch das Erreichen der Lernziele. Dies ist besonders wichtig in dieser Studie wegen der normalen Immunantwort auf die Infektion, kann die Frequenz der Bildverarbeitung und der Tatsache, dass transgene, Immuno-besteht, oder stark infizierten Tieren anfälliger gegenüber ionisierender Strahlung.
Bei der Planung der Versuch, eine 4D-Film der Infektion zu erzeugen, ist es wichtig, die Dauer des Experiments betrachten, scannt die Anzahl der in diesem Zeitraum μCT erforderlich, und die LD 50/30 für ionisierende Strahlung für die Maus-Stamm verwendet wird. Eine weitere mögliche Einschränkung DLIT-μCT ist die Stärke der Reporterexpression in den Bakterienstamm verwendet, da diese Bakterien Nachweisgrenzen und Aufnahmezeiten beeinflussen. Es wird dringend empfohlen, dass die Forscher verwenden Bakterienstämme, die voll virulent sind validiert, aber optimiert für maximale lux-Operon Ausdruck, wie zuvor für BLI nachgewiesen2,3.
Eine Einschränkung auf die aktuelle Gestaltung der 4D-Bildgebung ist, dass jeder Film der einzelnen DLIT-μCT Scans, die unterschiedliche Skalierung haben Photonen besteht. Dies kann die Bilder schwer zu interpretieren, wenn die Änderungen an der Lokalisierung der Brennpunkte BL oder seine Intensität subtil sind, oder wenn es einen intensiven Fokus BL durch mehrere schwache Herde umgeben. Daher ist für Längs Visualisierungen, ist es wichtig, dass die Farbbalken konsistent zu Zeitpunkten.
Das Konzept eines 4D-Film der Infektion kann zu einem entsprechend gekennzeichneten bakteriellen Krankheitserreger eingesetzt werden. Zukünftige Entwicklung dieser Technik wird darauf abzielen, Fluoreszenz-Imaging-Tomographie (FLIT) sowie DLIT verwenden, um die Untersuchung der Host Reaktionen auf Infektion mit einer Kombination von Biolumineszenz bakterielle Erreger und injizierbare fluoreszierenden Nahinfrarot-Sonden, um Host-Reaktionen auf Infektionen untersuchen zu erleichtern. Darüber hinaus, in diesem Protokoll wir nurbeschreiben die Verwendung von Biolumineszenz Bakterien 4D Filme der Infektion erstellen. In einigen Fällen kann es erforderlich sein, fluoreszenzmarkierten Bakterien, beispielsweise mit iRFP markiert, so dass die Biolumineszenz Reporter zur Untersuchung Wirtsgenetik während der Infektion verwendet werden können. Wichtig ist, dass die Verwendung von Multi-Bildgebung kombiniert DLIT / FLIT-μCT es uns ermöglichen, nicht-invasiv zu untersuchen mehrere Parameter während einer bakteriellen Infektion, die einen bedeutenden Beitrag zur Reduzierung, Verfeinerung und Ersatz der Verwendung von Tieren in der wissenschaftlichen Forschung wie in der NC3R Initiative (umrissen http://www.nc3rs.org.uk/ ).
Disclosures
Produktion und den freien Zugang zu diesem Artikel ist durch PerkinElmer gesponsert.
Die Autoren Kevin P, Francis, Jeff Meganck und Chaincy Kuo sind Mitarbeiter von Caliper-A PerkinElmer Company.
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Tiere Scientific Procedures Act 1986 durchgeführt und wurden von der lokalen Ethikkommission genehmigt.
Acknowledgments
Die in-vivo-Bildgebung Anlage am Imperial College wurde von der MRC finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
| Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
| Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
| Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
| Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
| Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
| Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
| 50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
| Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
| 1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
| Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
| Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
| IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
| 6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
| XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
| XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
| Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
| Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 | |
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References
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