Summary
Multimodalitet imaging är en värdefull metod för att studera bakteriell kolonisation i små djurmodeller. Detta protokoll beskriver infektion hos möss med självlysande
Abstract
Detta protokoll beskriver de steg som krävs för att longitudinellt följa en självlysande bakteriell infektion med komposit 3D diffus tomografi ljus avbildning med integrerad μCT (DLIT-μCT) och den efterföljande användningen av dessa data för att generera en fyrdimensionell (4D) film av infektionen cykeln. Att utveckla 4D infektion filmer och att validera DLIT-μCT avbildning för bakterieinfektion studier med en IVIS Spectrum CT, använde vi infektion med självlysande C. rodentium, som orsakar självbegränsande kolit hos möss. I detta protokoll, beskriva vi infektionen hos möss med självlysande C. rodentium och non-invasiv övervakning av kolonisering av daglig DLIT-μCT imaging och bakteriell uppräkning från avföring för 8 dagar.
Användningen av IVIS Spectrum CT underlättar sömlös samtidig registrering av optiska och μCT skanningar med en enda avbildning plattform. Den låga dosen μCT modalitet möjliggör avbildning av mössvid flera tidpunkter under infektion, som ger detaljerad anatomisk lokalisering av självlysande bakterie härdar i 3D utan att orsaka artefakter från den kumulativa strålningen. Viktigt är 4D filmer av infekterade möss ger ett kraftfullt analysverktyg för att övervaka bakteriekolonisation dynamik in vivo.
Introduction
Små djurmodeller, i synnerhet de som utnyttjar möss, används rutinmässigt för att undersöka bakteriell patogenes eller testa åtgärdsstrategier för infektioner, såsom antibiotika, probiotika, prebiotika och vacciner 1-7. De viktigaste experimentella readouts från små djur infektioner är patogen belastning, spatial och temporal lokalisering av infektionen, och förändringar i immunsvaret hos den infekterade organismen. In vivo optisk imaging är ett värdefullt verktyg för infektionssjukdomar forskning och kan användas för att övervaka flera experimentella avläsning genom användning av reportergener (luciferas, fluorescerande proteiner, beta-laktamas, etc), fluorescerande färgämnen, nanopartiklar eller kemiluminiscerande prober riktade till ett protein, biologisk process, eller en mikroorganism 6.
Bioluminescence imaging (BLI) är en optisk avbildning modalitet som används för att övervaka kolonisering av små djur, såsom möss och råttor, genom patogena bakterieria 3,6,8,9. Möss infekterade med rekombinanta bakterier som uttrycker en luciferas, såsom lux CDABE operonet från Photorhabdus luminescens. Kan dessa bakterier sedan detekteras genom deras ljus produktion använder en CCD baserad in vivo imaging system 3,6,9. Viktigt endast metaboliskt aktiva mikroorganismer är självlysande (BL), vilket endast livsdugliga bakterieceller detekteras genom denna metod 10,11. Använda 2D BLI, placeringen av BL källan härledas från ytan av djuret där signalen ljuder 8. Den exakta anatomiska lokalisering av BL härdar in vivo måste bestämmas genom ex vivo analys av organ 3,6,9 Däremot kan sammansatta 3D diffust ljus imaging tomografi (DLIT) användas för att sammanställa en kvantitativ 3D rekonstruktion av BL källa 12. DLIT utförs genom att samla BL tagna bilder med definierade smala bandpass-optiska filter ochdärefter inmatning av dem i en diffus optisk tomografi 3D rekonstruktionsalgoritm 1,7,12,13.
För närvarande, är multi-modalitet avbilda den enda metod som finns tillgänglig för att få verklig icke-invasiv anatomisk lokalisering av självlysande foci in vivo utan behov av ex vivo-analys. Nyligen använde vi en kombination av DLIT co-registrerade μCT imaging att utvärdera Citrobacter rodentium (C. rodentium) kolonisering dynamik efter profylaktisk behandling med en probiotisk bakterie 7. C. rodentium är en mus specifik enterisk patogen som används för att modellera mänsklig infektion med enteropatogena och enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. rodentium infektion orsakar kolit, vanligtvis förknippas med mild viktminskning, diarré, polariserade Th1 immunsvar och distinkta patologiska förändringar, inklusive kolon kryptan hyperplasi och fästa och effacing lesion formatiden 14. Utöver detta, C. rodentium patogenes har studerats ingående med hjälp BLI och dess dynamik kolonisering i C57BL/6J-möss är väl dokumenterade, vilket gör denna bakterie en idealisk modell mikroorganism för användning med multimodalitet imaging 3,4,7.
Detta protokoll är det första att beskriva en metod för samordnad DLIT-μCT avbildning av en bakteriell infektion med en enda plattform multimodalitet imaging, IVIS Spectrum CT, samt generering av en 4D film som visar den verkliga dynamiken i denna infektion icke-invasivt.
Protocol
Ett. Möss Framställning
- Köp eller föda upp tillräckligt 18-20 g C57BL/6J-möss krävs för att studera.
- Om möss köps från en extern leverantör, efter transport till anläggningen, vänja möss för 1 vecka på autoklaveras mat och vatten för att stabilisera tarmfloran.
- Väg, öron notch, och separera erforderligt antal möss per bur.
- Dagen före infektion, innan du utför någon anestesi, kontrollera att det finns tillräckligt syre och isofluran under hela proceduren. Om det behövs, tillsätt mer isofluorane eller byt syrgasflaskan. Därefter kontrollerar vikten av bedövningsmedlet asätare, om de har fått mer än 50 g sedan deras första användningen, kassera dem och ersätta med färska asätare.
- Söva möss med 3% isofluorane i XGI-8 anestesi System och Vaxning använder Veet för 7 min.
- Anmärkningar:
- Grundlig depilation är nödvändig, särskilt isvarta möss som melanin i pälsen dämpar avsevärt självlysande signalen 3,15.
- Depilering av möss varar vanligtvis 8-10 dagar innan pälsen börjar växa ut. För att utföra 4D multimodalitet imaging över längre perioder, Vaxning möss när det behövs så att det intressanta området är naken för avbildning sessioner.
- Möss är inrymt i en biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) inneslutning anläggning.
2. Bakteriell Cellberedning
- Förbered nog Luria Burtani buljong och agarplattor kompletterade med Kanamycin [50 | ig ml -1] krävs för att studera och förvara vid 4 ° C tills de behövdes.
- Dagen innan infektionen tina en cryovial av C. rodentium stam ICC180 och omedelbart lägga ett cryobead till 15 buljong ml LB kompletterad med Kanamycin [50 mikrogram ml -1] och kultur natten vid 220 rpm, 37 ° C. Som en kontroll för medelstora förorening, utarbeta ytterligareicke inokulerat 15 ml LB-buljong kompletterad med Kanamycin [50 | ig ml -1] och kulturen vid 220 rpm, 37 ° C.
- Nästa morgon (~ 16 tim), kolla på medellång kontroll för grumlighet som ett tecken på bakteriell tillväxt. Om kontrollen är klar, överföra ICC180 kulturen till en falk rör och centrifugera vid 4000 rpm. Därefter tvätta bakteriell pelleten i PBS. Sedan återsuspendera i 1,5 ml PBS (1/10: e av den ursprungliga volymen av LB kompletterat med Kanamycin) och blanda noga för att skapa den bakteriella ympen.
- För att kontrollera att ICC180 har odlats på rätt sätt och är självlysande före infektion av mössen, bild ympen i IVIS Spectrum CT använder BLI och den automatiska inställningen i Living Image 4.3.1 guiden som beskrivits tidigare 1.
Anmärkning:- Stam ICC180 är en bioluminescent derivat av vild typ C. rodentium ICC169 2. Denna bakteriestam har lux CDABE operonet inklusive ett Kanamycin resistens-genen insatt i en pseudogen av xylE i kromosomen 2.
- Utför all bakteriell odling med sedvanlig aseptisk teknik och vid behov antingen köpa sterila förbrukningsartiklar / reagenser eller autoklaveras före användning.
- I steg 2.4 kan bioluminescens behandlingen (p / s / cm 2 / sr) användas för att uppskatta bakterieantal före infektion av möss.
Tre. Infektion av möss med Bioluminescent C. rodentium och Bedömning av bakteriell kolonisering
- Före infektion, kontrollera att det finns tillräckligt syre och isofluran under hela proceduren. Om det behövs, tillsätt mer isofluorane eller byt syrgasflaskan. Därefter kontrollerar vikten av bedövningsmedlet asätare, om de har fått mer än 50 g sedan deras första användningen, kassera dem och ersätta med färska asätare.
- Söva möss med 3% isofluorane med ett XGI-8 anestesisia System för att tillhandahålla human återhållsamhet.
- Blanda den bakteriella inokulatet noggrant och drar 0,2 ml (ca 5 x 10 9 cfu ICC180) i sprutan.
- Ta bort möss från anestesisystemet en i taget och nackskinnet dem med ett ordentligt tag i huden bakom nacken med tummen och pekfingret.
- Tryck sondmatning nålen mot gommen, under tungan, och ner i matstrupen och injicera den bakteriella ympen i magen.
- Efter oral sondmatning av möss, övervaka deras gångstil och andning för tecken på stress, som kan vara ett tecken på att den bakteriella ympen har levererats in i lungorna. Euthanize några möss som har ympats i lungorna.
- Sondmatning infekterade möss med 200 l PBS som en fordonskontroll, som beskrivs i steg 3,1-3,6.
- För att bekräfta att oral sondmatning utfördes korrekt bild infekterade och mock-infekterade möss i IVIS Spectrum CT använder BLI och den automatiska inställningen i LivingBild 4.3.1 guiden beskrivits tidigare 1.
- Bestäm antalet livskraftiga bakterier i ympen genom seriell spädning i PBS och spotting i tre exemplar på LB agar kompletterad med Kanamycin [50 mikrogram ml -1].
- Beräkna antalet ICC180 cfu / ml genom att hitta en utspädning där det finns ungefär 5 till 50 kolonier och räkna antalet kolonier från varje fläck vid denna utspädning och registrera den utspädning som kolonierna räknades på. Därefter beräknas det genomsnittliga antalet cfu (från de tre platserna) och multiplicera detta värde med spädningsfaktorn 50 (varje plats är 20 pl den ursprungliga 1 ml prov) och utspädningen kolonierna räknades på, ge cfu / ml.
- Övervaka kolonisering av mössen dagligen genom att samla avföring från varje mus i en förvägd Eppendorf-rör (viktad på en fin balans) och späd 1/10 i PBS, baserat på vikten av provet (0,1 g ml -1).
- Bestäm antalet livskraftiga bakterier iavföring genom seriell spädning i PBS och spotting i tre exemplar på LB agar kompletterad med Kanamycin [50 mikrogram ml -1].
- Beräkna antalet viabla bakterier per gram av avföring genom att följa steg 3,9, sedan multiplicera antalet cfu / ml med den fekala utspädningsfaktor i PBS (steg 3.10) av 0,1 g ml -1 för att ge cfu / g.
- För att bestämma att möss inokulerades med en ren ICC180 kultur och att alla av kolonierna är bioluminescent. Ta agarplattorna från steg 3.8, bedöma bakteriekoloni morfologi antingen genom ögat eller plocka en representativ koloni från plattan och analysera med ljusmikroskop. Vid behov, kan bakteriell identifiering utföras genom stamspecifik koloni-PCR för att bedöma kultur renhet. Därefter bild plattorna i IVIS Spectrum CT använder BLI beskrivs i steg 3,7 och kontrollera att 100% av kolonierna på plattan är självlysande.
Anmärkningar:- Under 3.4 steg, när du sätter in sondmatning nålenOm du känner motstånd inte tvinga sondmatning nålen, eftersom detta orsakar ympen att gå in i lungorna. Istället, sätt tillbaka nålen och försiktigt försöka igen.
- Steg 3.1 är frivillig och möss kan vara muntligt sondmatades utan bedövning beroende på instituten djurskyddspolitik.
- Pallar måste ströks ut samma dag som de samlas in. C. rodentium kommer att växa även om de lämnas vid 4 ° C över natten i PBS och kommer att orsaka en kvantifiering av cfu / g avföring vara felaktig.
4. Daglig Composite 3D diffust ljus Imaging Tomography med μCT Imaging (DLIT-μCT) av infekterade möss
Djurskyddet: DLIT-μCT innebär DLIT optisk avbildning integrerad med en snabb, låg stråldos μCT scan (~ 23 mGy för två mus scan, ~ 53 mGy för en enda mus scan) av ett stillastående djur. Denna dos ackumuleras med varje avbildning session, så målet är att hålla den dos som low som möjligt (och alltid långt under LD 50/30) och samtidigt åstadkomma studien. I vissa fall, om det inte finns något tecken på infektion hos en konventionell BLI genomsökning av möss, kan μCT skanningen undvikas för att ytterligare minimera dosen. Även om dosen hålls så låg som möjligt, i förlängda studier om det finns någon oro för strålning, kommer möss gallras vid första tecken på skadliga symtom eller vid slutet av μCT avbildning perioden.
- Innan avbildning, initiera IVIS Spectrum CT och kontrollera att X-ray säkerhetsspärrar fungerar och att den uppvärmda scenen är vid rätt temperatur (37 ° C) för avbildning. Därefter, kontrollera nivån av isoflourane i anestesi-systemet och vikten av bedövningsmedlet asätare. Om det behövs, tillsätt mer isofluorane och om de asätare har fått mer än 50 g sedan deras första användningen, kassera dem och ersätta med färska asätare.
- Ställ in Spectrum CT så att avbilda parametrar somkör automatisk exponering funktionen i Living Image 4.3.1 är optimerade för avbildning bakteriell luciferas. Välj Redigera> Inställningar> Förvärv och Auto Exposure Window. Välj sedan> intervallvärden> Exp. Tid (sekunder) och ställ in> Max. till 300s. Slutligen väljer du> Target Count (minimum)> Självlysande och satt till 10.000 punkter.
- Sätt i en plattform musen avbildning i Spectrum CT och lod det i anestesi.
- Slå på röntgen säkerhetsspärr och initiera IVIS.
- När IVIS Spectrum CT har initierats, söva möss med 3% isofluorane med ett XGI-8 anestesi-system för att ge human återhållsamhet.
- För att avgöra om det är nödvändigt att utföra en DLIT-μCT scan, pre-image mössen använder BLI som tidigare 1 beskrivits, i en mus imaging plattform. Om en robust signal erhålls musen är lämplig för DLIT avbildning. Låt sövda mus i en mus imaging platform efter BLI scan redo för DLIT-μCT.
- Använd Imaging Wizard i Living Image programvara 4.3.1 för att ställa upp den DLIT-μCT scan. Den Imaging Wizard avgör automatiskt FOV, exponeringstid, F-stop och binning för DLIT och FOV, exponeringstid, filter set och binning för μCT bildbehandling för att ge bästa signal-brus-förhållande. När du uppmanas Imaging Wizard, innehålla endast 560, 580, 600 och 620 nm filter utsläpp och välj en mus μCT scan. Klicka sedan på> Förvärva att starta avbildning.
- Återför sövda mus till sin bur efter att avbilda, ta bort en plattform musen avbildning från Spectrum CT och desinficera med 1% Tri-genen. Om det behövs, byt skum pad att musen är placerad på att minimera risken för korskontaminering mellan möss.
- Bild möss dagligen upp till dag 8 efter infektion (PI) med DLIT-μCT, som beskrivs i steg 4,1 till 4,8, för att generera de längsgående avbilda data som krävs för att göra en 4D movie för infektion.
Anmärkning:- I steg 4.7, rekommenderar vi användning av de 560-620 filter nm utsläpp till bild bakteriell mareld. Även toppen av bakteriell mareld är omkring 485 nm, beroende på vävnad optik (den betydande dämpning av blå / gröna fotoner från murina vävnad), är det viktigt att använda de orange / röda fotoner för 3D rekonstruktioner eftersom det underlättar beräkning av signalen djup .
- 'AUTO' exponeringsinställningarna i Living Image 4.3.1 för DLIT behöva justeras för att optimera mängden infångade fotoner och maximal avbildning tid som används för varje filter set.
- Det är endast nödvändigt att utföra BLI pre-avbildning beskrivs i steg 4,6 när forskaren är inte säker på om det finns en påvisbar självlysande signalen, till exempel när man använder en ny infektion modell.
Fem. 3D-rekonstruktion av DLIT-μCT bilddata
- Open Living Image programvara 4.3.1 och välj>, Bläddra och öppna mappen som innehåller de DLIT-μCT filer.
- Öppna DLIT-μCT fil i Living Image Browser, till exempel C. rodentium Dag 1 PI genom att klicka på Load.
- I verktygspaletten väljer du> yttopografin> Nude mus, justera tröskeln, och klicka sedan på> Generate Surface. Om ytan rekonstruktion lyckas en yta kontur kommer att visas i 3D-vyn fönstret.
- Om du vill visa den renderade μCT skanna i 3D-vyn fönster, dölja ytan kontur (Klicka> 3D optiska verktyg och avmarkera> Display Surface Objekt), eller minska ytan opacitet (Klicka> 3D optiska verktyg och justera> bar Opacitetsväljare).
- Att ge detaljerad anatomisk lokalisering av 3D DLIT rekonstruktion är det nödvändigt att ändra de volymetriska 3D-data (μCT scan) så att endast musens skelettet är synligt och att den har optimal kontrast. Klicka> 3D multimodalitet verktyg och välj> Logarithmic Histogram, Gradient Belysning, Kvalitet och Denoise. Slutligen, justera histogram åt höger och titta på 3D-volymetriska dataändring kontrast. Håll justera uppgifterna tills bara benen syns tydligt. Om så önskas, ändra färg för poäng överföringsfunktion på histogrammet.
- Nästa select> DLIT 3D återuppbyggnad i verktygspaletten och se till att endast 560, har 580, 600 och 620 nm filter set, som krävs för avbildning bakteriell luciferas in vivo, valts ut. Klicka> Starta. Den Data Preview Fönster-menyn visas nu visar spektralt filtrerade BL signaler från musen som avbildades i 2D. Dessa signaler automatiskt thresholded av programvaran, men kan justeras manuellt om nödvändigt med hjälp av flikarna längst ned på menyn. Tröskeln bestäms den lägsta uppgifter intensitet (representerad som en procentandel av den maximala signalen i bilden) som kommer att ingå som data i återuppbyggnaden.
- Nästa select> DLIT 3D-rekonstruktion i verktygspaletten och kontrollera att de optiska egenskaper som används för DLIT rekonstruktion är korrekta. Välj> fliken Egenskaper och kontrollera att inställningarna för vävnadens egenskaper är inställd på musen vävnad Källa Spectrum inställd till bakterier.
- Klicka> Rekonstruera att utföra DLIT rekonstruktion.
- För att generera den DLIT-μCT 3D-film på> Verktyg> 3D-animering och välj> Preset Animations> CCW Y-axeln och> Total Duration> 10 sek (25 bilder per sekund). När inställningarna för 3D-animation är korrekta press> Spela in och spara DLIT-μCT 3D rekonstruktioner som. Avi-filer märkta med experiment, grupp och tidpunkt i en separat mapp.
Anmärkning:- Det är viktigt när man utför 3D-rekonstruktioner av DLIT-μCT data för att använda en dator med Living Image 4.3.1 och servicepaket 1 installerats och att datorn har ett grafikkort som lämpar sig för att köra multimodalitet programvara avbildning. Thär programvara kan laddas ner, och GPU specifikationer finns i release notes ( http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm ).
- Om DLIT-μCT 3D rekonstruktioner visas baklänges efter att ha sparat, är datorn kör en gammal version av sin grafikdrivrutin och detta kan åtgärdas genom att ladda ner en uppdatering från tillverkarnas hemsida.
- I steg 5, presenterar vi våra inställningar för att generera 3D DLIT-μCT rekonstruktioner. Det finns dock flera punkter under 3D rekonstruktioner där parametrar som inte diskuteras i detta protokoll kan modifieras. För en omfattande guide till 3D rekonstruktioner med Living Image 4.3.1 hänvisas till tillverkarens bruksanvisning.
- Det är viktigt att skapa 3D-rekonstruktioner med identiska inställningar i multimodalitet imaging verktyg så att de är jämförbara. Förutomdetta, när du skapar DLIT-μCT 3D rekonstruktioner, är det viktigt att göra videor med samma antal bilder per sekund och total längd (längd), annars tidpunkten för 4D-video är inte homogen.
6. Generation av en 4D film av C. rodentium Infektion
- Tydligt märka alla DLIT-μCT 3D rekonstruktioner med rätt experiment, tidpunkt och grupp i en lättillgänglig mapp.
- Skapa en ny fil i Windows Live Movie Maker och infoga DLIT-μCT rekonstruktioner i kronologisk ordning från dag 1 PI hjälp av fliken Verktyg i mappen framställd i steg 6.1.
- Lägg till bildtexter till början av varje video som beskriver tidpunkt, till exempel Dag 1 PI genom att välja lämpligt DLIT-μCT video och sedan välja Start> Lägg Caption. En textruta visas på skärmen, där den lämpliga legenden tillsättes. Justera Teckenstorlek, stil, färg och motivering som desired med identiska flikar till Microsoft Word i programvaran verktygsfältet. Slutligen, flytta bildtexten till det övre vänstra hörnet av videon.
- Upprepa steg 7.3 för alla DLIT-μCT videos.
- Lägg en titelsida, till exempel C. rodentium infektion dagar 1-8 genom att klicka på Start> Titel. En textruta visas på skärmen där den lämpliga titeln sätts till en tom bild. Justera Teckenstorlek, stil, färg och motivering returresa med identiska flikar till Microsoft Word i programvaran verktygsfältet.
- Spara projektet som Movie Maker-projektet * MMP i en lämplig mapp med titeln på filmen. Detta steg är nödvändigt om du vill ändra filmen.
- Spara filmen som en. Wmv-fil. Klicka på menyn Movie Maker> Spara film> för datorn.
- Konvertera filen movie maker med en fil omvandlare till. Avi eller annan lämplig filtyp är kompatibel med datorn.
Anmärkningar:- Det rekommenderas att de 4D filmergenereras på en PC med Windows Live installerat Movie Maker ( http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker ) och en bra multi-media program som kan spela. wmv eller. avi filtyper.
Representative Results
Infektion av C57BL/6J-möss med 5 x 10 9 cfu C. rodentium är en väl beskriven bakterieinfektion modell och resulterar i en självbegränsande gastrointestinal infektion som toppar mellan dagar 6-8 efter infektion och varar mellan 3 till 4 veckor 2,14. Infektionen är begränsad till den intestinala lumen av murina immunsystemet och som en konsekvens, är bakterier kontinuerligt skjul i avföringen. Kolonisering av möss av C. rodentium kan övervakas icke-invasivt genom direkt bakteriell uppräkning från avföring, eller mareld avbildning 2,3.
Detta manuskript beskriver ett optimerat protokoll för att utföra 3D och 4D multimodalitet avbildning av C. rodentium inom möss för att övervaka bakteriehalten och lokalisering under infektion. Resultaten som presenteras i Figur 1 visar de kontroller som krävs för en lyckad 4D avbildning. Före infektion i möss är det viktigt att avskräckagruvan som den bakteriella ympen som används är självlysande (Figur 1A) och att efter oral sondmatning av en mus med självlysande C. rodentium, att signalen kan observeras i magen av djuret och inte i lungorna (Figur 1B) 16.
Förutom att övervaka bakteriell kolonisering med mareld avbildning, är det god praxis att kvantifiera antalet bakterier i avföring, som används som ett indirekt mått på bakteriell kolonisering av mag-tarmslemhinnan Figur 2 visar typiska bakteriehalten i avföring tas från 8 C57BL6 / J. möss som infekterats med ~ 5 x 10 9 cfu ICC180 och övervakas i 8 dagar PI Colonization ökar från dag 2 PI tills dag 6-7 var infektionen toppar på ~ 5 x 10 10 cfu / g, vilket är i linje med tidigare rapporter 2,3,17.
För att understryka vikten av utvärting smittspridning i en enda mus, figurerna 1b och 3 samt Video 1 har genererats från samma mus efter C. rodentium infektion, såsom beskrivits ovan. Daglig DLIT-μCT användes för att utvärdera den rumsliga fördelningen av självlysande bakterier inom denna mus, med skelett som en anatomisk referens. Visar DLIT-μCT rekonstruktion av en C57BL/6J mus infekterad med ICC180 vid 3 nyckel tidpunkter PI At figur 3 dag 3 PI små självlysande foci kan observeras i tjocktarmen, som uppvisar en måttlig ökning av mareld intensitet vid dag 5 PI med lite ändrade geografiska fördelningen. Vid dag 7 PI vi observerade en signifikant ökning av mareld och självlysande härdar spridda över hela tjocktarmen.
Video 1 är en sammanställning av 3D DLIT-μCT rekonstruktioner från dagarna 1-8 PI med ICC180 och illustrerar C.rodentium inom den proximala gastrointestinala området mellan dagarna 1-2 PI som sprider sig till tjocktarmen på dag 3 PI Från dag 4-6 PI de bakteriella nummer i tjocktarmen expanderar tills topp på dag 7 PI där den bakteriella foci täcker hela tjocktarmen. På dag 8 PI endast två distinkta bakteriella härdar ses i den proximala och distala colon. Förmågan att se hela 3D-rekonstruktion vid varje tidpunkt i kronologisk ordning utgör ett kraftfullt verktyg för att analysera interaktioner värd patogen och är lättare att tolka än en 3D fortfarande av samma datamängd.
Figur 1. 2D bioluminescens avbildning av A) Bioluminescent C. rodentium ICC180 inokulatet och B) en mus efter oral sondmatning med 200 | il av inokulat. Pilspets (>) illustrerar bioluminescent C. rodentium em> i magen.
Figur 2. C. rodentium kolonisering dynamik. Kvantifiering av C. rodentium kolonibildande enheter från avföring för 8 dagar PI
Figur 3. Diffust ljus imaging tomografi-μCT genomsökning av självlysande C. rodentium infektion från en mus övervakas vid dag 3, 5 och 7 PI Arrowhead (>) illustrerar kolon kolonisering. Klicka här för att visa en större bild .
Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv "target =" _blank "> Klicka här för att se videon. 4D film av C. rodentium infektion från en mus övervakas från dagarna 1-8 PI
Discussion
Den 4D film av bakteriell infektion ger ett användbart verktyg för att visualisera och tolka stora mängder av multimodalitet imaging data snabbt och enkelt. Denna teknik underlättar detaljerad analys av hur en infektion sprids genom en individuell mus och kan användas för att undersöka hur borttagning av värd eller bakteriella gener eller särskilda strategier ingripande verkan bakteriehalten, distribution och lokalisering vid en longitudinell studie 7. Dessa filmer ger också användbara läromedel och ett sätt att sprida information till allmänheten.
Det finns flera viktiga steg i detta protokoll som kan påverka kvaliteten på de uppgifter som erhållits från DLIT-μCT bildbehandling och förmågan att sammanställa en 4D video för infektion. Den viktigaste delen av detta protokoll är den framgångsrika och homogen infektion av möss med C. rodentium. Det är väsentligt att de möss som användes för studien är mellan 18 till 20 g och att bakterieella inoculums är nygjord och cirka 5 x 10 9 CFU, som beskrivits tidigare 2,3. Före infektion av mössen är det viktigt att kontrollera att ympen är självlysande med Spectrum CT och när ympen har upprättats, måste den ständigt homogeniseras innan varje mus sondmatades att mössen få liknande infektiösa doser. Den DLIT-μCT avbildning av möss har optimerats så att den automatiska exponeringen fungerar i Living Image 4.3.1 automatiskt bestämmer optimerade imaging parametrarna för signalen att vara väl över bruset. Dock bygger den automatiska exponeringen fungerar på användardefinierade inställningar och parametrar som måste modifieras som beskrivs i proceduren. Underlåtenhet att göra detta kommer att resultera i dåliga bilder med ett lågt antal fotoner samlats som inte leder till en uppenbar progression i infektionen, eftersom Spectrum CT fabriksinställningar för exponeringsautomatiken är programmerade för avbildning tumörer som uttryckereldflugeluciferas. Rekonstruktioner utföras med 560-620 nm ger den bästa överenskommelsen mellan simulerade och uppmätta data, och därför är de mer tillförlitliga data som ska inkluderas i återuppbyggnaden.
En begränsning till användningen av DLIT-μCT är att joniserande strålning från μCT scan orsakar subletal strålningsskador som är kumulativ över en longitudinell studie 18. Sub-dödande strålningsexponering kan försvaga immunförsvaret, orsaka DNA-skada, och apoptos i inre organ 19. Ytterst kan kumulativa subletal strålningsskador orsaka dödsfall om LD 50/30 för joniserande strålning överskrids, vilket är mellan 5 till 7 Gy beroende på musstammen och ålder av mössen använde 18,20,21. Även om en del av den molekylära skador från joniserande strålning kan läka, eftersom den övergripande principen är att uppskatta dos konservativt, är detta inte normalt redovisas i studieplanering. Istället är målet att hålla sig så långt belOW dessa gränser som möjligt samtidigt utföra de studiemål. Detta är särskilt viktigt i denna studie på grund av det normala immunsvaret på infektion, kan frekvensen för bildframställning, och det faktum att transgena, immunblot-bestod, eller kraftigt infekterade djur vara mer mottagliga för joniserande strålning.
Vid planering av experiment för att skapa en 4D film av infektion, är det viktigt att beakta längden av experimentet, skannar antalet μCT krävs under denna period och LD 50/30 för joniserande strålning för musstammen används. En annan potentiell begränsning till DLIT-μCT är styrkan reportern uttryck inom den bakteriestam som används, eftersom detta kommer att påverka bakteriella detektionsgränser och tider avbildning. Det rekommenderas starkt att forskare använder validerade bakteriestammar som är fullt virulent, men optimerad för maximal lux-operon uttryck, vilket visas tidigare för BLI2,3.
Ett varningens ord till den nuvarande utformningen av 4D avbildning är att varje film består av enskilda DLIT-μCT skanningar som har olika fotonen skalning. Detta kan göra bilderna svårtolkade om ändringar i lokaliseringen av BL härdar, eller dess intensitet är subtila, eller om det finns en intensiv BL fokus omgiven av flera svaga foci. Därför, för längsgående visualiseringar, är det viktigt att hålla färgfälten konsekvent mellan tidpunkterna.
Begreppet en 4D film av infektion kan tillämpas på någon lämpligt etiketterad bakteriell patogen. Framtida utveckling av denna teknik kommer att sträva efter att använda fluorescens avbildning tomografi (FLIT) samt DLIT att underlätta utredningen av värdens svar på infektion med en kombination av självlysande bakteriella patogener och injicerbara fluorescerande nära infraröda prober för att undersöka värd svar på infektion. Utöver detta, i detta protokoll vi barabeskriver användningen av självlysande bakterier för att skapa 4D filmer av infektion. Men i vissa fall kan det vara nödvändigt att använda fluorescensmärkta bakterier, t ex taggade med IRFP, så att bioluminescens reportern kan användas för att undersöka värd genetik under infektion. Huvudsakligen kommer användningen av multimodalitet imaging kombinerar DLIT / FLIT-μCT tillåter oss att icke-invasivt undersöka flera parametrar under en bakteriell infektion, vilket kommer att bidra avsevärt till att minska, förfina och ersätta användningen av djur i vetenskaplig forskning som beskrivs i NC3R initiativ ( http://www.nc3rs.org.uk/ ).
Disclosures
Produktion och fri tillgång till den här artikeln är sponsrad av PerkinElmer.
Författarna Kevin P, Francis, Jeff Meganck och Chaincy Kuo är personer från Caliper-A PerkinElmer Company.
Alla djurförsök har utförts i enlighet med de djur Scientific Procedures Act 1986 och har godkänts av den lokala etiska kommittén för översyn.
Acknowledgments
Den in vivo imaging anläggning vid Imperial College finansierades av MRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
| Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
| Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
| Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
| Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
| Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
| Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
| 50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
| Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
| 1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
| Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
| Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
| IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
| 6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
| XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
| XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
| Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
| Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 | |
|
|||
References
- Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice. J. Vis. Exp. (48), e2547 (2011).
- Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).
- Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6, 963-972 (2004).
- Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract. Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).
- Fanning, S., et al. Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).
- Collins, J. W., et al. Pre-treatment with Bifidobacterium breve UCC2003 modulates Citrobacter rodentium-induced colonic inflammation and organ specificity of infection. Microbiology. , 10-1099 (2012).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995).
- Hardy, J., et al. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303, 851-853 (2004).
- Szittner, R., Meighen, E. Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium. J. Biol. Chem. 265, 16581-16587 (1990).
- Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J. Antimicrob. Chemother. 67, 404-414 (2012).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J. Biomed. Opt. 12, 024007 (2007).
- Cronin, M., et al. High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting. PLoS One. 7, e30940 (2012).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cell Microbiol. 7, 1697-1706 (2005).
- Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Mol. Imaging Biol. 13, 1114-1123 (2011).
- Wiles, S., Crepin, V. F., Childs, G., Frankel, G., Kerton, A. Use of biophotonic imaging as a training aid for administration of substances in laboratory rodents. Lab Anim. 41, 321-328 (2007).
- Crepin, V. F., et al. Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo. Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).
- Willekens, I., et al. Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol. ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).
- Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. Small-animal X-ray dose from micro-CT. Mol Imaging. 3, 149-158 (2004).
- Sato, F., Sasaki, S., Kawashima, N., Chino, F. Late effects of whole or partial body x-irradiation on mice: life shortening. Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 39, 607-615 (1981).
- Kohn, H. I., Kallman, R. F. The influence of strain on acute x-ray lethality in the mouse. II. Recovery rate studies. Radiat. Res. 6, 329-338 (1957).
