Adenoviral transduktion af Naive CD4 T-celler til at studere Treg Differentiering

Summary

Adenoviral genoverføring i naive CD4 T-celler med transgen ekspression af Coxsackie adenovirus receptoren muliggør molekylær analyse af regulatoriske T-celle differentiering<em> In vitro</em>.

Abstract

Regulatoriske T-celler (tregs) er vigtigt at give immuntolerance over for selv samt til visse fremmede antigener. Tregs kan genereres fra naive CD4 T-celler in vitro med TCR-og co-stimulering i nærvær af TGFp og IL-2. Det bærer et enormt potentiale for fremtidige behandlinger dog molekylerne og signalveje, der kontrollerer differentiering er stort set ukendte.

Primære T-celler kan manipuleres gennem ektopisk genekspression, men fælles metoder undlader at målrette den vigtigste naive tilstand af T-celle forud for primær antigengenkendelse. Her giver vi en protokol til at udtrykke ektopiske gener hos naive CD4 T-celler in vitro, før induktion Treg differentiering. Den anvender transduktion med replikationsdefekt adenovirus og forklarer dets produktion og produktion. Adenovirus kan tage op store indsatser (op til 7 kb), og kan udstyres med initiativtagere at opnå en høj og forbigående overexpression i T-celler. Det effektivt transducerer naive mus T-celler, hvis de udtrykker en transgen Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Vigtigere er det, efter infektion af T-cellerne forbliver naiv (CD44 ^lav, CD62L ^høj) og hvile (CD25 ^-, CD69 ^-) og kan aktiveres og differentierede til tregs minder om ikke-inficerede celler. Således er denne metode giver mulighed manipulation af CD4 T-celle differentiering lige fra begyndelsen. Det sikrer, at ektopisk genekspression er allerede på plads, når tidlige signalering begivenheder i det oprindelige TCR stimulering inducerer cellulære ændringer, der i sidste ende føre til Treg differentiering.

Introduction

Tregs er afgørende at fastholde immun tolerance og til at dæmpe overskridelse immunrespons. Tregs undertrykke tilskuer T-celleaktivering. Derfor ablation af tregs fører til fatal autoimmunitet og selvdestruktion drevet af aktiverede T celler ^1.. Tregs udvikle sig i thymus under negativ selektion af CD4 enkelt-positive prækursorer, men de kan også differentiere i periferien fra naive CD4 T-celler upon lavdosis antigenstimulering med suboptimal co-stimulation ^1,2. Thymisk tregs synes at undertrykke væv autoimmunitet mod selv-antigener, mens perifer tregs har været impliceret i at yde tolerance i tarmen eller lungerne. Disse inducerede tregs potente forhindre T-celle aktivering efter indregning af udenlandske antigener i slimhinden, herunder miljø-antigener fra fødevarer og luft, kommensale bakterier og allergener ^3,4. Desuden er tregs afgørende at etablere maternel tolerance over føtale peptider ⁵ og til preaftræk graft-versus-host sygdom ^6.. På samme tid, også tregs medierer uønskede virkninger ved at dæmpe immunovervågning af tumorceller ^7,8. Kendetegnet træk tregs er udtryk for delmængde-angivelse transskription faktor Foxp3, en gaffel-head domæne-holdige transskription faktor, der er nødvendig og tilstrækkelig til at give Treg funktion ^9,10. Nogle signalveje, der kan fremkalde Foxp3 udtryk er kendt. Imidlertid er de molekylære processer, der styrer, regulerer eller modulerer Treg differentiering i respons på T-celle receptoren udløser mindre godt forstået.

Tregs kan meget effektivt induceres in vitro ved stimulering af naive CD4 T-celler med anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer i nærvær af TGFp og IL-2 ^11. Som det spirende tregs er funktionelle in vivo, manipulation af molekyler, der fremmer Treg differentiering bærer et enormt potentiale for fremtidig therapies, f.eks. behandling af astma, Crohns sygdom, og transplantation ^11,12 Omvendt kan terapeutisk modulation af molekyler til at blokere Treg differentiering giver fordele i fremtidige tilgange kombineret behandling af tumor patienter.

In vitro differentiering assays har været medvirkende til beskrivelse af molekylære ændringer, der er forbundet med T-celle delmængde differentiering. I øjeblikket. Eksperimentelle forsøg på søgning eller screene for genprodukter, der styrer T-celle differentiering er hæmmet af, at de mest almindelige metoder til ektopisk genekspression mislykkes i naive T-celler For eksempel er elektroporation og retroviral transduktion kun effektiv i aktiverede T-celler. I modsætning til de oprindelige forventninger, lentiviral transduktion, som typisk er effektiv i hvilende celler, kræver forudgående aktivering af naive T-celler ved cytokiner ^13.. Endvidere overførsel af cDNA eller mRNA under elektroporationinvolverer depolarisering af plasmamembranen, som selv giver funktioner af T-celleaktivering, og kan endda mobilisere Ca ^{2 +-signalering} og aktivere NFAT proteiner (upubliceret observation og ref. ^14). Tilsvarende for retroviral transduktion, har den naive T-celler, der skal aktiveres i 18-40 timer. I løbet af denne tid sker en opdeling af kernemembranen under celledeling og muliggør efterfølgende genomisk integration af den retrovirale vektor ^15.. Disse metoder er derfor ikke i stand til at løse den tidlige molekylære regulering af indledende T-celle møde med antigen, der er den afgørende fase af hjælper-T-celle differentiering.

Adenoviral transduktion er kendt for at give forbigående ektopisk genekspression i en række humane celletyper, der udtrykker den humane Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Den fortsætter uden krav om celleaktivering eller cellecyklusfremadskriden. Overfladen ekspression af CAR er afgørende for effektiv virus fastgørelse og internalisering, og transgene ekspression af den trunkerede version, CARΔ1 under en T-celle-specifik promotor blev fundet at gøre musethymocytter og T-celler er modtagelige for adenovirusinfektion ^16. Vigtigt er transgenet ikke ændre thymocyt udvikling eller in vitro differentiering af naive CD4 T-celler i forskellige undergrupper (data ikke vist, ref ^17..). Adenovirus-medieret transduktion af T-celler er tidligere blevet anvendt til overekspression ^17,18 og knock-down-tilgange ^19,20. De transgene T-celler kan oprenses fra kommercielt tilgængeligt DO11.10 TG, CARΔ1 tg (Taconic, Inc. og ref ^17..). Vigtigere er, adenoviral transduktion muliggør høj ekspression af et gen af ​​interesse i naive T-celler uden at inducere tydelige tegn på aktivering. T-cellerne forbliver naive (CD44 ^lav, CD62L ^høj) og hvile (CD25 ^-, CD69 ^-) efter infectipå og kan aktiveres og differentierede til Treg minder om ikke-inficerede celler.

Produktion af rekombinante adenovira kan opnås efter transfektion af HEK293A celler med adenovirale plasmider (figur 1). Disse plasmider indeholder typisk human type 5 adenovirus genomet med E1-og E3 deleteret at gøre rekombinante adenovira replikation-inkompetente ^21. HEK293A celler supplerer replikation mangel, som de er blevet udødeliggjort gennem stabil integration af klippet adenovirus ^22.. Da adenovirusvektorer er store (~ 40 kb) og følgelig ikke velegnet til traditionel restriktionsenzym-medieret kloning, anvendte vi Gateway systemet. Genet af interesse er først klonet ind i en mindre post vektor, hvorfra det let kan overføres til den adenovirale destination vektor via lambda rekombinationsreaktion (LR) ^23. Vi konstrueret pCAGAdDu vektorenved at kombinere CAG promotor (kylling actinpromotoren og CMV-enhanceren) med en ekspressionskassette indeholdende LR flankerer den prokaryote CCDB selektionsmarkør ^24. Denne ekspressionskassette fusioneret til et internt ribosomindgangssted (IRES) element, der tillader coekspression af eukaryote infektion markør forstærket grønt fluorescerende protein (eGFP), der er fusioneret til en sekvens indeholdende bovint væksthormon poly (A)-signal. Vi valgte CAG cis-regulatoriske sekvenser, da prototypisk CMV-promotoren blev fundet at være meget aktiveringen afhængige og derfor ugunstig for genekspression i naive T-celler.

Her giver vi en protokol til effektiv in vitro Treg differentiering og en fremgangsmåde til at transducere naive CD4 T-celler uden aktivering (fig. 2). Metoden giver mulighed for ektopisk genekspression eller vælte foregående CD4 T-celle differentiering på naive tilstand. Det gør det muligt at teste virkningen af ​​en overexpressed gen af ​​interesse i den tidlige signaleringsbegivenheder upon indledende TCR stimulering indtil T-celle delmængde engagement. Vores validering eksperimenter også give et grundlag for at etablere tilsvarende adenovirus anvendelse i differentieringen af ​​andre T-celle delmængder såsom Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, eller TFH celler.

Protocol

1.. Kloning af et gen af ​​interesse i en indtastning Vector Klone genet af interesse ind i en post vektor. PCR-amplifikation af genet efterfulgt af stump-ende-ligering ind i en topoisomerase-koblet vektor (f.eks pENTR / D-TOPO) eller restriktionsenzym-medieret kloning kan anvendes til denne procedure. 2.. Overførsel af genet af interesse i pCAGAdDu Destination Vector Overfør genet af interesse fra posten vektor i destinationen vektor af LR rekombin…

Representative Results

Virusproduktion For generation af high virustitere er timingen af ​​HEK293A cellehøst i den primære virus produktion eller virus forstærkning afgørende. Repræsentative fluorescerende og fasekontrast billeder med visuelle tegn på virus produktion er vist i figur 3.. CPE blev observeret 10 dage efter transfektion af HEK293A celler med en kontrolgruppe pCAGAdDu vektor uden indsats. CPE er kendetegnet ved fremkomsten af ​​områder med forstørrede og round-up celler, …

Discussion

Virus Generation og titrering

For at opnå optimale transfektion resultater vises kvaliteten og mængden af ​​lineariseret vektor vigtigste. Vi har ikke observere negative virkninger på den primære lysat produktion fra en indledende overvækst af kulturen da infektionen vil hurtigt videre, når effektiv virus produktionen finder sted. Dog kan virusproduktion ved HEK293A celler upåvirket af lange skær, der sænker effektiviteten. Nogle åbne læserammer blev faktisk fundet at interferere…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	11791020
PacI	New England Biolabs	R057S
jetPEI	Polyplus-transfection	101-10N
HEK293A Cell Line	Invitrogen	R705-07
A549	ATCC	CCL-185
6-well plates	BD Falcon	353046
14 cm tissue culture dish	Nunc	168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr	Taconic Farms	Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II	Miltenyi Biotech	130-094-131
DMEM	Invitrogen	41966-052
FBS	PAN Biotech	1502-P110704
PenStrep	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
NaPyruvate	Lonza	BE13-115E
NEAA 100x	Lonza	BE13-114E
L-Glutamine	Invitrogen	25030
HEPES Buffer Solution (1 M)	Invitrogen	15630-056
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x)	Lonza	13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation	Invitrogen	114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1	R&D Systems	240B
Proleukin S (18 x 106IE)	Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L-23105
Mouse BD Fc BlockT	BD Pharmingen	553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE	eBioscience	12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay	Roche Applied Biosystems	4427975
LightCycler 480 Probes Master	Roche Applied Biosystems	04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Roche Applied Biosystems	4366596