Erhvervelse Fluorescens Time-lapse film fra Spirende Gær og analysere encellede Dynamics hjælp poder
Summary
Vi præsenterer en simpel protokol til at opnå fluorescensmikroskopi film af voksende gærceller, og en GUI-baseret software pakke til at udtrække encellede tidsseriedata. Analysen omfatter automatiserede afstamning og division tid opgave integreret med visuel inspektion og manuel datasikring sporede data.
Abstract
Fluorescens time-lapse mikroskopi er blevet et magtfuldt redskab i studiet af mange biologiske processer på enkelt-celle niveau. Især giver film skildrer den tidsmæssige afhængighed af genekspression indsigt i dynamikken i dens regulering, men der er mange tekniske udfordringer til at indhente og analysere fluorescens film af enkelte celler. Vi beskriver her en simpel protokol ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt mikrofluid kultur-enhed til at generere disse data, og et Matlab-baseret, grafisk brugergrænseflade (GUI)-baseret softwarepakke til at kvantificere de fluorescens billeder. Den software segmenter og spor celler, giver brugeren mulighed for at visuelt kuratere fejl i data, og tildeler automatisk afstamning og division tider. GUI yderligere analyserer tidsserier til at producere helcelle spor såvel som deres første og anden gang derivater. Mens softwaren blev designet til S. cerevisiae, bør dens modulopbygning og alsidighed tillader det to fungere som en platform for at studere andre celletyper med få modifikationer.
Introduction
Single-cell analyse af genekspression har fremmet vores forståelse af mange aspekter af genregulering. Statiske snapshots af fluorescerende reporter udtryk ved hjælp af flowcytometri eller mikroskopi giver nyttige oplysninger om fordelingen af encellede udtryk, men mangler den historie og udviklingen af tidsseriedata, der er nødvendige til direkte at underrette genekspression dynamik. Fluorescens time-lapse mikroskopi præsenterer et middel til at opnå både encellede målinger og deres historie. Forskellige eksperimentelle og analytiske teknikker er blevet udviklet til at opnå og kvantificere film af fluorescerende reporter udtryk, og dermed bibringe indsigt i genregulering funktioner (se 1 for en gennemgang) såsom celle-til-celle variation 2,3, bakteriel persister formation 4, transskription initiering og forlængelse 5, transcriptional sprængfyldt 6,7, celle-cyklus afhængighed 8,9 og heritabilitet 10. Men OBTaining kvalitet encellede fluorescens tidsserier indebærer betydelige tekniske udfordringer i dyrkning et monolag af celler i en kontrollerbar miljø og i high-throughput kvantificering af de erhvervede fluorescens film. Her beskriver vi en procedure for at opnå og analysere fluorescens film af S. cerevisiae med ingen krævede erfaring i cellekultur enhedens fremstilling eller i software udvikling (figur 1).
Først, vi detalje et eksempel protokol til at generere fluorescens tidsserier film spirende gær udtrykker én eller flere fluorescerende journalister. Selvom tilpassede mikrofluid kultur kamre er blevet bygget, og med held tidligere 11-13, bruger vi en kommercielt tilgængelig mikrofluid enhed fra CellAsic (Hayward, CA). Systemet begrænser celler til monolag vækst og muliggør kontinuerlig kontrol af perfusion miljø. Det mikroskopi-protokollen præsenterer vi er en enkel måde at opnå fluorescerENCE film af spirende gær, men enhver ændret forsøgsprotokol (en tilpasset kultur-enhed, alternative medieforhold, osv.) yder det samme fluorescens filmdataene af enkelt gærceller kan erstattes.
Dernæst vi skitsere en analyse af de film ved hjælp af en grafisk brugergrænseflade (GUI)-baseret softwarepakke i MATLAB (Mathworks, Natick, MA), døbt GUI til hurtig analyse af fluorescens Time Series (Transplantater), at udtrække tidsseriedata til enkeltceller. Poder har lignende funktioner til den alsidige, open-source software-pakke celle-ID 14 i segmentere og sporing celler og i udvinding fluorescens intensitet og geometriske oplysninger. Men poder giver vigtige ekstra funktioner. For det første giver nem interaktiv redigering af segmentering og sporing resultater at kontrollere data nøjagtighed, snarere end blot statistisk gating af outlier regionens spor efter analyse. Desuden udvider analyse automatically designerede afstamning og celle-cyklus punkter af interesse for spirende gær. Bestemme, hvornår mor og datter deler at danne to uafhængige celle regioner er afgørende at afgøre helcelle (mor herunder eventuelle tilsluttede hovedtelefoner) målinger gennem hele cellecyklus 8.. Suiten består af tre moduler til at udføre disse opgaver. De første segmenter celle regioner baseret på kontrasten mellem fokuseret og ufokuseret lyse field billeder, og giver brugeren mulighed for at definere og visuelt teste segmentering parametre. Den anden spor (. Bruger Blair og Dufresne s MATLAB implementering af Crocker m.fl. IDL rutine, findes på: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) og måler celle regioner gennem tiden, tildeler automatisk slægter, og muliggør visuel inspektion og fejlretning. En simpel plotte GUI er medtaget for at query encellede egenskaber. Det tredje modul tilskriver opløbet opståen og division TImes, og udsender helcelle tidsseriedata såvel som deres første og anden gang derivater (som omtalt i 9). Analysen modulet udlæser dataene som en mellemrums-adskilt tekstfil til senere undersøgelse i den statistiske software valg. Således pakke aktiverer brugeren til at udtrække høj kvalitet tidsseriedata via en grafisk brugerflade. Vi har anvendt denne metode til at estimere realtid transskriptionshastigheder i enkelte spirende gærceller som en funktion af cellecyklus 9.. Mens modulerne er blevet optimeret til spirende gær, parametrene eller om nødvendigt, den frit tilgængelige koden kan tilpasses til andre organismer og billedtyper. Segmentering, sporing og slægt overdragelse algoritmer kan være specifik for typer af tildelte billedbehandling og den pågældende organisme. De eksisterende algoritmer kunne erstattes, men stadig bevare den grafiske interface, der tillader brugervenlig visuel inspektion og korrektion af segmentering og sporing af fejl, der uvægerligt erhvervspsykolor med enhver algoritme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ovennævnte protokol beskriver en enkel metode til at opnå og analysere fluorescens tidsseriedata med begrænset erfaring i microfluidics eller softwareudvikling. Det tillader en at opnå time-lapse fluorescens film af enkelt gærceller, udtrække relevante celle størrelse og udtryk målinger kapellan sporing og slægt opgaver og analysere adfærden for hele celler over tid ved hjælp af en kommercielt tilgængelig mikrofluid kultur enhed og en alsidig grafisk bruger (GUI). Mens eksperimentelle, segmentering og sporin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Emily Jackson, Joshua Zeidman og Nicholas Wren for kommentarer til softwaren. Dette arbejde blev finansieret af GM95733 (til NM), BBBE 103316 og MIT opstart midler (til NM).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Y04C Yeast Perfusion Plate | CellAsic | Y04C-02 | |
| ONIX Microfluidic Perfusion Platform | CellAsic | EV-262 | |
| Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | ||
| Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Cascade II EMCCD camera | Photometrics | ||
| Lumen 200 metal-halide arc lamp | PRIOR Scientific | ||
| Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set | Chroma Technology Corp | set #89006 | Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato) |
| MAC 5000 controller and filter wheels | Ludl Electronic Products | ||
| MATLAB R2011a | Mathworks | 64-bit version handles large data files better than 32-bit |
References
- Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. Signaling-mediated bacterial persister formation. Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).
- Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332 (6028), 472-474 (2011).
- Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).
- Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. , (2013).
- Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5 (9), e239 (2007).
- Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024 (2005).
- Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).
- Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3 (1), e1468 (2008).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).
- Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).
- To, T. -. L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).
- O’Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O’Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271 (5246), 209-212 (1996).
- Raser, J. M., O’Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).
