Acquiring Fluoreszenz Zeitraffer-Filme von Bäckerhefe und Analysieren von Einzel-Zell-Dynamics mit Transplantaten
Summary
Wir präsentieren ein einfaches Protokoll zur Fluoreszenzmikroskopie Filme von wachsenden Hefezellen und eine GUI-basierte Software-Paket, um Single-Cell-Zeitreihen extrahieren zu erhalten. Die Analyse umfasst automatisierte Linie und Teilung Zeitzuweisung mit Sichtprüfung und manuelle curation der verfolgten Daten integriert.
Abstract
Fluoreszenz-Zeitraffer-Mikroskopie hat sich zu einem mächtigen Werkzeug für die Untersuchung vieler biologischer Prozesse auf der Ebene einzelner Zellen. Insbesondere bieten Filme Darstellung der zeitlichen Abhängigkeit der Genexpression Einblick in die Dynamik seiner Regelung, aber es gibt viele technische Herausforderungen zu erhalten und zu analysieren Fluoreszenz Filme von Einzelzellen. Wir beschreiben hier ein einfaches Protokoll mit einem kommerziell erhältlichen Gerät mikrofluidischen Kultur, solche Daten zu erzeugen, und ein MATLAB-basierte, grafische Benutzeroberfläche (GUI)-basierten Software-Paket, um die Fluoreszenz-Bildern zu quantifizieren. Die Software-Segmenten und Spuren Zellen, kann der Benutzer visuell kuratieren Fehler in den Daten und ordnet Linie und Teilung Zeiten. Die GUI weitere Analysen der Zeitreihe Ganzzell Spuren sowie deren erste und zweite zeitliche Ableitung zu erzeugen. Während die Software wurde entwickelt, S. cerevisiae, sollte seine Modularität und Vielseitigkeit ermöglichen es to dienen als Plattform für die Untersuchung anderer Zelltypen mit wenigen Änderungen.
Introduction
Einzel-Zell-Analyse der Genexpression gefördert hat unser Verständnis vieler Aspekte der Genregulation. Statische Schnappschüsse von fluoreszierenden Reporter Expression mittels Durchflusszytometrie oder Mikroskopie bieten nützliche Informationen über die Verteilung der Single-Cell-Ausdruck, aber es fehlt die Geschichte und Entwicklung der Zeitreihen erforderlichen Daten direkt informieren Genexpression Dynamik. Fluoreszenz-Zeitraffer-Mikroskopie stellt ein Mittel, um sowohl Single-Cell-Messungen und ihre Geschichte zu erhalten. Verschiedene experimentelle und analytische Techniken entwickelt worden, zu erhalten und zu quantifizieren Filme von fluoreszierenden Reporter Ausdruck verleihen somit Einblicke in Genregulation Features (siehe 1 für eine Übersicht) wie Zell-zu-Zell-Variation 2,3, bakterielle persister Bildung 4, Transkription Initiierung und Dehnung 5, Transkriptions Platzen 6,7, Zellzyklus-Abhängigkeit 8,9 und 10 Erblichkeit. Allerdings obtaining Qualität Single-Cell-Fluoreszenz Zeitreihen mit erheblichen technischen Herausforderungen bei der Kultivierung eine Monoschicht von Zellen in einer kontrollierbaren Umgebung und in High-Throughput-Quantifizierung der Fluoreszenz erworbenen Filme. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Beschaffung und Analyse von Filmen Fluoreszenz S. cerevisiae ohne erforderliche Erfahrung in der Zellkultur Gerät Herstellung oder in der Software-Entwicklung (Abbildung 1).
Erstens, wir ausführlich ein Beispiel-Protokoll zur Fluoreszenz Zeitreihen filme für Bäckerhefe, die ein oder mehrere fluoreszierende Reporter erzeugen. Obwohl maßgeschneiderte mikrofluidischen Kultur Kammern errichtet worden sind und erfolgreich eingesetzt zuvor 11-13, verwenden wir einen handelsüblichen Mikrofluidikvorrichtung von CellAsic (Hayward, CA). Das System beschränkt Zellen Monoschicht Wachstum und ermöglicht kontinuierliche Kontrolle der Perfusion Umwelt. Die Mikroskopie Protokoll präsentieren wir ein einfaches Mittel, um fluoresz erhaltenENCE Filme von Bäckerhefe, aber jede Änderung experimentelle Protokoll (eine angepasste Kultur Gerät, alternative Medien Bedingungen, etc.), was ähnliche Fluoreszenz Filmdaten einzelner Hefezellen substituiert sein kann.
Nächstes skizzieren wir die Analyse der Filme über eine grafische Benutzeroberfläche (GUI)-basierten Software-Paket in MATLAB (MathWorks, Natick, MA), nannte die GUI für die schnelle Analyse von Fluoreszenz Time Series (Transplantate), um Zeitreihen zu extrahieren für einzelne Zellen. Transplantate hat ähnliche Eigenschaften der vielseitigen, Open-Source-Software-Paket Handy-ID 14 in Segmentierung und Tracking-Zellen und bei der Gewinnung Fluoreszenzintensität und geometrischen Informationen. Allerdings sieht Transplantate wichtige zusätzliche Funktionen. Erstens bietet es einfach interaktive Bearbeitung der Segmentierung und Tracking-Ergebnisse zu Genauigkeit der Daten, anstatt nur statistische Ausreißer Gating der Region Spuren nach der Analyse zu überprüfen. Darüber hinaus erstreckt sich die Analyse auf automatically bezeichnen Abstammung und Zellzyklus-Sehenswürdigkeiten in der Nähe von Bäckerhefe. Festlegen, wann Mutter und Tochter, zwei unabhängige Zelle Regionen bilden teilen ist entscheidend für die Bestimmung ganzen Zelle (Mutter einschließlich damit verbundener bud) Messungen während des Zellzyklus 8. Die Suite besteht aus drei Modulen, um diese Aufgaben zu erfüllen. Die ersten Segmente Zelle Regionen auf dem Kontrast zwischen Schärfe und Unschärfe Hellfeld Bildern basiert, und ermöglicht es dem Benutzer zu definieren und zu testen visuell Segmentierung Parameter. Der zweite Titel (. Verwendung Blair und Dufresne MATLAB Umsetzung der Crocker et al IDL Routine, verfügbar unter: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) und misst Zelle Regionen durch die Zeit; vergibt automatisch Linien und ermöglicht die visuelle Inspektion und Fehlerkorrektur. Eine einfache Plotten GUI wird zur Abfrage Single-Cell-Eigenschaften enthalten. Das dritte Modul schreibt Knospe Entstehung und Teilung times und gibt Ganzzell Zeitreihendaten sowie deren erste und zweite zeitliche Ableitung (wie in 9 beschrieben). Das Analyse-Modul gibt die Daten als durch Leerzeichen getrennte Textdatei für die nachfolgende Studie in der Statistik-Software der Wahl. Somit ermöglicht das Paket dem Anwender, qualitativ hochwertige Zeitreihendaten über eine grafische Schnittstelle zu extrahieren. Wir haben diese Methode verwendet, um Echtzeit-Transkription Preise in einzelnen Hefe-Zellen als Funktion des Zellzyklus 9 schätzen. Während die Module für Hefezellen, die Parameter oder optimiert worden sind, falls erforderlich, die frei verfügbare Code kann für andere Organismen und Bildtypen angepasst werden. Segmentierung, Tracking und Linie Zuordnungsalgorithmen kann spezifisch für Arten der Bildgebung zugewiesen und den Organismus in Frage. Die bestehenden Algorithmen konnte ersetzt werden, aber immer noch die GUI-Schnittstelle, die benutzerfreundliche visuelle Kontrolle und Korrektur der Segmentierung und Tracking-Fehler, die unweigerlich Berufs erlaubtr mit einem Algorithmus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das obige Protokoll beschreibt eine einfache Methode zu erhalten und zu analysieren Fluoreszenz Zeitreihendaten mit wenig Erfahrung in der Mikrofluidik oder in der Softwareentwicklung. Er erlaubt es, Zeitraffer-Filme Fluoreszenz einzelner Hefezellen erhalten; extrahieren relevante Größe der Zellen und die Expression Messungen; Pfarrer Tracking und Abstammung Zuweisungen und analysieren das Verhalten ganzer Zellen im Laufe der Zeit mit einem handelsüblichen Gerät mikrofluidischen Kultur und eine vielseitige grafische…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Emily Jackson, Joshua Zeidman und Nicholas Wren für Kommentare zu der Software. Diese Arbeit wurde von GM95733 (bis NM), BBBE 103316 und MIT Anschubfinanzierung (bis NM) finanziert.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Y04C Yeast Perfusion Plate | CellAsic | Y04C-02 | |
| ONIX Microfluidic Perfusion Platform | CellAsic | EV-262 | |
| Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | ||
| Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Cascade II EMCCD camera | Photometrics | ||
| Lumen 200 metal-halide arc lamp | PRIOR Scientific | ||
| Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set | Chroma Technology Corp | set #89006 | Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato) |
| MAC 5000 controller and filter wheels | Ludl Electronic Products | ||
| MATLAB R2011a | Mathworks | 64-bit version handles large data files better than 32-bit |
References
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