רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי
Summary
אנו מציגים פרוטוקול פשוט להשיג סרטי הקרינה מיקרוסקופיה של תאי שמרים גדלו, וחבילת תוכנה מבוססת GUI כדי לחלץ את נתוני זמן סדרת תא בודד. הניתוח כולל שושלת אוטומטית והקצאת זמן החלוקה משולבת עם בדיקה חזותית ואוצרות ידני של נתונים מסומנים.
Abstract
מיקרוסקופיה זמן לשגות הקרינה הפכה לכלי רב עוצמה בחקר תהליכים ביולוגיים רבים ברמת התא בודד. בפרט, סרטים המתארים את התלות הזמנית של ביטוי גנים לספק תובנות לגבי הדינמיקה של הרגולציה שלה, עם זאת, ישנם אתגרים טכניים רבים לקבלת וניתוח של סרטי הקרינה של תאים בודדים. אנו מתארים כאן פרוטוקול פשוט באמצעות מכשיר microfluidic תרבות זמין מסחרי כדי להפיק נתונים כאלה, וממשק מבוסס MATLAB, משתמש גרפי (GUI) מבוססת חבילת תוכנה לכמת את תמונות הקרינה. מגזרי התוכנה ותאי מסלולים, מאפשרים למשתמש לאצור חזותי טעויות בנתונים, ומקצים באופן אוטומטי שושלת וזמני החלוקה. GUI נוסף מנתח את סדרת הזמן לייצר כל עקבות סלולריים, כמו גם נגזרות בפעם הראשונה והשנייה שלהם. בעוד התוכנה תוכננה עבור ס cerevisiae, מודולריות והרבגוניות שלו צריכה לאפשר לו לאo לשמש כפלטפורמה ללימוד סוגי תאים אחרים עם כמה שינויים.
Introduction
ניתוח תא בודד של ביטוי גנים שקדם את ההבנה של היבטים רבים של ויסות הגנים שלנו. תמונות סטטיות של ביטוי ניאון כתב באמצעות cytometry זרימה או מיקרוסקופיה לספק מידע שימושי על חלוקת ביטוי תא בודד, אבל חסרה את ההיסטוריה והאבולוציה של נתוני סדרת זמן הנדרשים כדי להודיע ישירות דינמיקת ביטוי גנים. מיקרוסקופיה זמן לשגות הקרינה מציגה אמצעים כדי להשיג את שני מדידות תא בודדות ואת ההיסטוריה שלהם. ניסיוני בטכניקות ואנליטיות שונות פותחו כדי להשיג ולכמת סרטים של ביטוי ניאון כתב, ובכך הקניית תובנות תכונות ויסות הגנים (ראה 1 לביקורת), כגון תא אל תא וריאציה 2,3, היווצרות חיידקי persister 4, שעתוק ייזום והתארכות 5, תעתיק מתפוצץ 6,7, תלות מחזור תא 8,9, ותורשתיות 10. עם זאת, obtסדרת זמן הקרינה aining איכות תא בודד כרוכה באתגרים טכניים משמעותיים בculturing monolayer של תאים בסביבה לשליטה וכימות בתפוקה גבוהה של הקרינה בסרטים שנרכשו. כאן, אנו מתארים הליך להשיג ולנתח את סרטי הקרינה של ס ' cerevisiae ללא ניסיון הנדרש בייצור מכשיר תרבית תאים או בפיתוח תוכנה (איור 1).
ראשית, אנו פירוט פרוטוקול דוגמה ליצירת סרטי סדרת זמן הקרינה לשמרי ניצנים הביעו אחד או יותר כתבי ניאון. למרות שכבר נבנו תאי microfluidic תרבות מותאמים אישית והועסקו בעבר בהצלחה 11-13, אנו משתמשים במכשיר microfluidic זמין מסחרי מCellAsic (הייוורד, קליפורניה). מערכת תאי הגבולות לצמיחה monolayer ומאפשר שליטה מתמדת של סביבת זלוף. פרוטוקול מיקרוסקופיה אנו מציגים הוא אמצעי פשוט להשיג fluorescסרטי ence של שמרי ניצנים, אלא כל פרוטוקול ניסויי שונה (מכשיר תרבות מותאם אישית תנאי מדיה חלופיים, וכו '). מניבים נתונים סרט הקרינה דומים של תאי שמרים בודדים עשויים להיות תחליף.
בשלב הבא, אנו מתארים את הניתוח של הסרטים באמצעות ממשק משתמש גרפי (GUI) מבוססת חבילת תוכנה בMATLAB (MathWorks, Natick, MA), המכונה GUI עבור ניתוח מהיר של סדרות עתיות הקרינה (שתלים), כדי לחלץ נתונים זמן סדרה לתאים בודדים. יש שתלי תכונות דומות לתוכנת 14 צדדי, הקוד פתוח חבילה נייד-ID בפילוח ומעקב אחר תאים וחילוץ בעוצמת הקרינה ומידע גיאומטרי. עם זאת, שתלים מספק תכונות חשובות נוספות. ראשית, היא מציעה עריכה אינטראקטיבית קלה של פילוח ותוצאות מעקב כדי לוודא דיוק הנתונים, ולא רק gating הסטטיסטי של עקבות אזור outlier לאחר ניתוח. יתר על כן, הוא מרחיב את הניתוח לautomaticallשושלת המיועדת y ונקודות מחזור תא עניין של שמרי ניצנים. קביעה כאשר האם והבת מתחלקות ליצירת שני אזורים סלולריים עצמאיים היא חיונית לקביעת תא כולו (אם לרבות כל ניצן מחובר) מדידות לאורך כל מחזור 8 התאים. החבילה מורכבת משלושה מודולים כדי לבצע משימות אלה. האזורים הסלולריים הקטעים הראשונים המבוססים על הניגוד בין תמונות שדה בהירות ממוקדות ולא ממוקדות, ומאפשר למשתמש להגדיר ולבחון את פרמטרים חזותי פילוח. המסילה השנייה (. באמצעות בלייר והיישום של Dufresne MATLAB של אל שגרת קרוקר et IDL, זמינה בכתובת: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/) ומודדת אזורים סלולריים דרך זמן; מקצה אוטומטית שושלות, ומאפשרת בדיקה ויזואלית ותיקון שגיאות. GUI זומם פשוט כלול לנכסי תא בודד השאילתה. המודול השלישי מייחס ניצן הופעה והחלוקה TIMES, ומוציא כפלט את כל נתוני תא סדרת הזמן, כמו גם נגזרים בפעם הראשונה והשנייה שלהם (כפי שנדון ב9). מודול ניתוח פלטי את הנתונים כקובץ טקסט מופרדי רווחים למחקר שלאחר מכן בתוכנה הסטטיסטית של בחירה. לפיכך, החבילה מאפשרת למשתמש לחלץ נתוני סדרת זמן באיכות גבוהות באמצעות ממשק גרפי. יש לנו להשתמש בשיטה זו כדי להעריך שיעורי שעתוק בזמן אמת בתאי שמרי ניצנים בודדים כפונקציה של מחזור התא 9. בעוד שמודולים שעברו אופטימיזציה עבור שמרי ניצנים, הפרמטרים או, במידת צורך, הקוד זמין באופן חופשי יכול להיות מותאם לאורגניזמים אחרים וסוגי תמונות. פילוח, מעקב, ושושלת אלגוריתמי הקצאה עשויים להיות ספציפיים לסוגי הדמיה הוקצתה ואורגניזם בשאלה. את האלגוריתמים הקיימים יכולים להיות מוחלפים, אבל עדיין שומרים על ממשק GUI המאפשר מעקב שגיאות שתמיד occu בדיקה ותיקון של פילוח חזותי ידידותית למשתמש וR עם כל אלגוריתם.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול לעיל מתאר שיטה פשוטה לקבל ולנתח את נתוני סדרת זמן הקרינה עם ניסיון מוגבל במיקרופלואידיקה או בפיתוח תוכנה. זה מאפשר לאדם להשיג סרטי הקרינה זמן לשגות של תאי שמרים בודדים; לחלץ גודל תא רלוונטי ומדידות ביטוי; מעקב כומר ומטלות שושלת, ולנתח את ההתנהגות של תאים של?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאמילי ג'קסון, יהושע זיידמן, וניקולס רן להערות על התוכנה. עבודה זו מומנה על ידי GM95733 (לNM), 103,316 BBBE וקרנות הזנק (MIT לNM).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Y04C Yeast Perfusion Plate | CellAsic | Y04C-02 | |
| ONIX Microfluidic Perfusion Platform | CellAsic | EV-262 | |
| Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | ||
| Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Cascade II EMCCD camera | Photometrics | ||
| Lumen 200 metal-halide arc lamp | PRIOR Scientific | ||
| Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set | Chroma Technology Corp | set #89006 | Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato) |
| MAC 5000 controller and filter wheels | Ludl Electronic Products | ||
| MATLAB R2011a | Mathworks | 64-bit version handles large data files better than 32-bit |
References
- Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. Signaling-mediated bacterial persister formation. Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).
- Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332 (6028), 472-474 (2011).
- Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).
- Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. , (2013).
- Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5 (9), e239 (2007).
- Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024 (2005).
- Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).
- Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3 (1), e1468 (2008).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).
- Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).
- To, T. -. L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).
- O’Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O’Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271 (5246), 209-212 (1996).
- Raser, J. M., O’Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).
