नवोदित खमीर की प्रतिदीप्ति समय चूक सिनेमा हासिल करना और grafts का उपयोग कर एकल सेल गतिशीलता का विश्लेषण
Summary
हम प्रतिदीप्ति बढ़ रही खमीर कोशिकाओं के माइक्रोस्कोपी फिल्मों, और एकल कोशिका समय श्रृंखला डेटा निकालने के लिए एक जीयूआई आधारित सॉफ्टवेयर पैकेज प्राप्त करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल उपस्थित थे. विश्लेषण स्वचालित वंश और दृश्य निरीक्षण और ट्रैक किए गए डेटा का मार्गदर्शन curation के साथ एकीकृत विभाजन के समय असाइनमेंट शामिल है.
Abstract
प्रतिदीप्ति समय चूक माइक्रोस्कोपी एकल कोशिका स्तर पर कई जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन में एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है. विशेष रूप से, जीन अभिव्यक्ति की अस्थायी निर्भरता चित्रण फिल्मों इसके विनियमन की गतिशीलता में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, लेकिन, एकल कक्षों के प्रतिदीप्ति फिल्में प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए कई तकनीकी चुनौतियों का सामना कर रहे हैं. हम यहां इस तरह के डेटा उत्पन्न करने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microfluidic संस्कृति उपकरण का उपयोग कर एक सरल प्रोटोकॉल, और एक MATLAB आधारित, ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) आधारित सॉफ्टवेयर पैकेज प्रतिदीप्ति छवियों यों को वर्णन. सॉफ्टवेयर क्षेत्रों और पटरियों कोशिकाओं, उपयोगकर्ता नेत्रहीन डेटा में त्रुटियों उपपादरी करने के लिए सक्षम बनाता है, और स्वचालित रूप से वंश और विभाजन के समय प्रदान करती है. जीयूआई आगे पूरे सेल निशान के रूप में भी उनकी पहली और दूसरी बार के डेरिवेटिव के उत्पादन के लिए समय श्रृंखला विश्लेषण करती है. सॉफ्टवेयर एस के लिए डिजाइन किया गया था cerevisiae, इसके प्रतिरूपकता और चंचलता यह टी की अनुमति चाहिएकुछ संशोधनों के साथ अन्य प्रकार की कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक मंच के रूप में सेवा ओ.
Introduction
जीन अभिव्यक्ति की एकल कोशिका विश्लेषण जीन विनियमन के कई पहलुओं के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाया गया है. प्रवाह cytometry या माइक्रोस्कोपी का उपयोग फ्लोरोसेंट संवाददाता अभिव्यक्ति की स्टेटिक स्नैपशॉट एकल कक्ष अभिव्यक्ति के वितरण पर उपयोगी जानकारी प्रदान करते हैं, लेकिन इतिहास और सीधे जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता को सूचित करने के लिए आवश्यक समय श्रृंखला डेटा के विकास की कमी है. प्रतिदीप्ति समय चूक माइक्रोस्कोपी एकल कक्ष माप और उनके इतिहास दोनों को प्राप्त करने के लिए एक साधन प्रस्तुत करता है. विभिन्न प्रयोगात्मक और विश्लेषणात्मक तकनीकों इस प्रकार इस तरह के सेल करने वाली सेल भिन्नता 2,3, बैक्टीरियल persister गठन 4, प्रतिलेखन के रूप में जीन विनियमन सुविधाओं में अंतर्दृष्टि (एक समीक्षा के लिए 1 देखें) प्रदान करने, फ्लोरोसेंट संवाददाता अभिव्यक्ति की फिल्मों प्राप्त और यों के लिए विकसित किया गया है दीक्षा और बढ़ाव 5, 6,7 फोड़ ट्रांसक्रिप्शनल, सेल चक्र निर्भरता 8,9, और आनुवांशिकता 10. हालांकि, OBTaining गुणवत्ता एकल कक्ष प्रतिदीप्ति समय श्रृंखला संवर्धन में महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौतियों का एक चलाया हुआ वातावरण में और अधिग्रहण प्रतिदीप्ति फिल्मों के उच्च throughput मात्रा का ठहराव में कोशिकाओं की एक monolayer शामिल है. यहाँ, हम एस के प्रतिदीप्ति फिल्में प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन सेल संस्कृति डिवाइस के निर्माण में या सॉफ्टवेयर के विकास में कोई आवश्यक अनुभव (चित्रा 1) के साथ cerevisiae.
सबसे पहले, हम विस्तार से एक उदाहरण प्रोटोकॉल एक या एक से अधिक फ्लोरोसेंट संवाददाताओं व्यक्त नवोदित खमीर के लिए प्रतिदीप्ति समय श्रृंखला फिल्मों उत्पन्न करने के लिए. अनुकूलित microfluidic संस्कृति कक्षों का निर्माण किया है और सफलतापूर्वक पहले 11-13 नियोजित किया गया है, हालांकि हम CellAsic (हेवर्ड, सीए) से एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microfluidic डिवाइस का उपयोग करें. प्रणाली के दायरे monolayer के विकास के लिए कोशिकाओं और छिड़काव पर्यावरण के लगातार नियंत्रण की अनुमति देता है. हम वर्तमान माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल fluoresc प्राप्त करने के लिए एक सरल साधन हैखिलाडि़यों नवोदित खमीर की फिल्मों, लेकिन किसी भी संशोधित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल (एक स्वनिर्धारित संस्कृति डिवाइस, वैकल्पिक मीडिया की स्थिति, आदि.) एक खमीर कोशिकाओं के समान प्रतिदीप्ति फिल्म डेटा उपज प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
अगला, हम समय श्रृंखला डेटा निकालने के लिए एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) आधारित MATLAB में सॉफ्टवेयर पैकेज (Mathworks, Natick, एमए), प्रतिदीप्ति समय श्रृंखला का त्वरित विश्लेषण (grafts) के लिए जीयूआई करार दिया है, का उपयोग फिल्मों का विश्लेषण रूपरेखा एकल कक्षों के लिए. Grafts कोशिकाओं segmenting और ट्रैकिंग में और प्रतिदीप्ति तीव्रता और ज्यामितीय जानकारी निकालने में बहुमुखी, खुले स्रोत सॉफ्टवेयर पैकेज सेल आईडी 14 के समान सुविधाएँ है. हालांकि, grafts महत्वपूर्ण अतिरिक्त फीचर्स प्रदान करता है. सबसे पहले, यह विभाजन और डेटा सटीकता, बजाय विश्लेषण के बाद ग़ैर क्षेत्र निशान से सिर्फ सांख्यिकीय gating को सत्यापित करने के लिए ट्रैकिंग के परिणाम की आसान इंटरैक्टिव संपादन प्रदान करता है. इसके अलावा, यह automaticall को विश्लेषण फैलीवाई नामित वंश और नवोदित खमीर की ब्याज की सेल चक्र अंक. माँ और बेटी दो स्वतंत्र सेल क्षेत्रों के लिए फार्म विभाजित जब निर्धारण पूरे सेल (किसी भी जुड़े कली सहित मां) सेल चक्र 8 के दौरान माप का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है. सुइट इन कार्यों को पूरा करने के लिए तीन मॉड्यूल शामिल हैं. केंद्रित और अनफोकस्ड उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के बीच इसके विपरीत पर आधारित है, और पहली क्षेत्रों सेल क्षेत्रों उपयोगकर्ता विभाजन मानकों को परिभाषित और नेत्रहीन का परीक्षण करने की अनुमति देता है. दूसरा (. पर उपलब्ध ब्लेयर और क्रोकर एट अल आईडीएल दिनचर्या का Dufresne के MATLAB के कार्यान्वयन का उपयोग,: पटरियों http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) और समय के माध्यम से सेल क्षेत्रों के उपाय, स्वतः प्रजातियों प्रदान करती है, और दृश्य निरीक्षण के लिए सक्षम बनाता है और त्रुटि सुधार. एक साधारण साजिश रचने जीयूआई क्वेरी एकल कोशिका के गुण को शामिल किया जाता है. तीसरा मॉड्यूल कली उद्भव और विभाजन ती श्रेयएमईएस, और पूरे सेल समय श्रृंखला डेटा के रूप में भी उनकी पहली और दूसरी बार के डेरिवेटिव (के रूप में 9 में चर्चा) outputs. विश्लेषण मॉड्यूल चुनाव के सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में बाद के अध्ययन के लिए एक अंतरिक्ष सीमांकित पाठ फ़ाइल के रूप में डेटा outputs. इस प्रकार, पैकेज उपयोगकर्ता एक ग्राफिकल इंटरफ़ेस के माध्यम से उच्च गुणवत्ता के साथ समय श्रृंखला डेटा निकालने के लिए सक्षम बनाता है. हम सेल चक्र 9 के एक समारोह के रूप में एक नवोदित खमीर कोशिकाओं में वास्तविक समय प्रतिलेखन दरों में अनुमान लगाने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है. मॉड्यूल नवोदित खमीर, पैरामीटर या के लिए अनुकूलित किया गया है, यदि आवश्यक हो, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कोड अन्य जीवों और छवि प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. विभाजन, ट्रैकिंग, और वंश असाइनमेंट एल्गोरिदम सौंपा इमेजिंग और प्रश्न में जीव के प्रकार के लिए विशिष्ट हो सकता है. मौजूदा एल्गोरिदम बदल दिया है, लेकिन अभी भी उपयोगकर्ता के अनुकूल दृश्य निरीक्षण और विभाजन के सुधार और कहा कि सदा ही occu ट्रैकिंग त्रुटियों की अनुमति देता है कि जीयूआई इंटरफेस बनाए रखने के लिए किया जा सकता हैकिसी भी एल्गोरिथ्म के साथ आर.
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊपर प्रोटोकॉल microfluidics में या सॉफ्टवेयर के विकास में सीमित अनुभव के साथ प्रतिदीप्ति समय श्रृंखला डेटा प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करता है. यह एक एकल खमीर कोशिकाओं के समय चूक प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सॉफ्टवेयर पर टिप्पणी के लिए एमिली जैक्सन, यहोशू Zeidman, और निकोलस रेन धन्यवाद. इस काम GM95733 (समुद्री मील दूर करने के लिए), BBBE 103,316 और एमआईटी स्टार्टअप धन (समुद्री मील दूर करने के लिए) द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Y04C Yeast Perfusion Plate | CellAsic | Y04C-02 | |
| ONIX Microfluidic Perfusion Platform | CellAsic | EV-262 | |
| Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | ||
| Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Cascade II EMCCD camera | Photometrics | ||
| Lumen 200 metal-halide arc lamp | PRIOR Scientific | ||
| Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set | Chroma Technology Corp | set #89006 | Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato) |
| MAC 5000 controller and filter wheels | Ludl Electronic Products | ||
| MATLAB R2011a | Mathworks | 64-bit version handles large data files better than 32-bit |
References
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