L'acquisizione di fluorescenza filmati time-lapse di lievito in erba e Analisi Dinamica singola cella utilizzando innesti
Summary
Vi presentiamo un semplice protocollo per ottenere filmati di microscopia a fluorescenza di crescita cellule di lievito, e un pacchetto software basato su GUI per estrarre i dati cella singola serie storica. L'analisi include lignaggio automatico e l'assegnazione a divisione di tempo integrato con ispezione visiva e curation manuale dei dati rilevati.
Abstract
Fluorescenza time-lapse microscopia è diventato un potente strumento per lo studio di molti processi biologici a livello di singola cellula. In particolare, i film che descrivono la dipendenza temporale di espressione genica fornire una conoscenza delle dinamiche della sua regolazione, tuttavia, ci sono molte sfide tecniche per ottenere e analizzare i film di fluorescenza di singole cellule. Descriviamo qui un semplice protocollo utilizzando un dispositivo cultura microfluidica disponibile in commercio per produrre tali dati, e una, interfaccia MATLAB basata utente grafica (GUI) basata su software per quantificare le immagini di fluorescenza. I segmenti software e cellule tracce, consente all'utente di curare visivamente errori nei dati, e assegna automaticamente lignaggio e tempi di divisione. La GUI analizza ulteriormente la serie temporale di produrre tracce cellule intere e le loro derivate prime e seconde tempo. Mentre il software è stato progettato per S. cerevisiae, la sua modularità e versatilità dovrebbero permettere tØ fungere da piattaforma per lo studio di altri tipi di cellule con poche modifiche.
Introduction
Analisi di singole cellule di espressione genica ha favorito la nostra comprensione di molti aspetti della regolazione genica. Istantanee statiche di espressione reporter fluorescente mediante citometria di flusso o microscopia forniscono utili informazioni sulla distribuzione di espressione singola cellula, ma non hanno la storia e l'evoluzione dei dati di serie storiche necessarie per informare direttamente le dinamiche di espressione genica. Fluorescenza time-lapse microscopia presenta un mezzo per ottenere entrambe le misure monocellulari e la loro storia. Varie tecniche sperimentali e analitiche sono state sviluppate per ottenere e quantificare i film d'espressione reporter fluorescente, conferendo così intuizioni funzioni di regolazione genica (vedi 1 per una rassegna) come variazione cella-a-cella 2,3, formazione persister batterica 4, trascrizione iniziazione e di allungamento 5, trascrizionale scoppio 6,7, ciclo cellulare dipendenza da 8,9, e ereditabilità 10. Tuttavia, OBTaining cella singola serie temporale fluorescenza di qualità comporta notevoli difficoltà tecniche coltura un monostrato di cellule in un ambiente controllabile e quantificazione in high-throughput dei film fluorescenza acquisiti. Qui, descriviamo una procedura per ottenere e analizzare i film di fluorescenza di S. cerevisiae con nessuna esperienza richiesta nella produzione di dispositivi di coltura cellulare o in fase di sviluppo del software (Figura 1).
In primo luogo, abbiamo dettagliatamente un protocollo di esempio per generare in tempo fluorescenza i film di serie per il lievito in erba esprimere uno o più giornalisti fluorescenti. Sebbene camere di coltura microfluidica personalizzati sono stati costruiti e impiegati con successo in precedenza 11-13, utilizziamo un dispositivo microfluidica disponibile in commercio da CellAsic (Hayward, CA). Le cellule del sistema limita a crescita monostrato e permette il controllo continuo dell'ambiente di perfusione. Il protocollo di microscopia che presentiamo è un semplice mezzo per ottenere flfilm senza di lievito in erba, ma qualsiasi protocollo modificato sperimentale (un dispositivo cultura personalizzata, condizioni di media alternativi, ecc.) che producono dati di filmati fluorescenza simili di cellule di lievito singoli possono essere sostituiti.
Successivamente, abbiamo delineare l'analisi dei filmati utilizzando una interfaccia grafica utente (GUI) basata su software in MATLAB (Mathworks, Natick, MA), soprannominata la GUI per analisi rapide del Tempo fluorescenza Series (INNESTI), per estrarre i dati di serie temporali per singole cellule. INNESTI ha caratteristiche simili al versatile, software open-source pacchetto Cell-ID 14 in segmentazione e monitoraggio delle cellule e nell'estrazione intensità di fluorescenza e di informazioni geometriche. Tuttavia, innesti fornisce importanti funzionalità aggiuntive. In primo luogo, offre un facile editing interattivo di segmentazione e monitoraggio dei risultati per verificare l'accuratezza dei dati, piuttosto che solo gating statistica dei valori anomali regione tracce dopo l'analisi. Inoltre, si estende l'analisi ai automatically designato lignaggio e punti del ciclo cellulare di interesse di lievito in erba. Determinare quando madre e figlia si dividono per formare due regioni di cellule indipendenti, è fondamentale per la determinazione delle cellule insieme (madre compresa qualsiasi gemma collegato) misurazioni durante tutto il ciclo cellulare 8. La suite si compone di tre moduli per eseguire queste operazioni. I primi segmenti regioni cellulari basati sul contrasto tra le immagini in campo chiaro mirate e vago, e permette all'utente di definire e verificare visivamente i parametri di segmentazione. Le seconde tracce (. Utilizzando Blair e MATLAB implementazione di Dufresne della Crocker et al IDL di routine, disponibili presso: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) e le misure regioni cellulari attraverso il tempo; assegna automaticamente lignaggi, e consente l'ispezione visiva e correzione di errori. Una semplice interfaccia grafica complotto è incluso per le proprietà cella singola query. Il terzo modulo attribuisce gemma emergere e divisione TImes, ed emette dati cellula intera serie temporali nonché le loro derivate prime e seconde tempo (come discusso in 9). Il modulo di analisi emette i dati come file di testo delimitato da spazi per studio successivo nel software statistico di scelta. Così, il pacchetto consente all'utente di estrarre dati di serie temporali di elevata qualità mediante un'interfaccia grafica. Abbiamo usato questo metodo per stimare i tassi di trascrizione in tempo reale in singole cellule di lievito in erba in funzione del ciclo cellulare 9. Mentre i moduli sono stati ottimizzati per il lievito in erba, i parametri o, se necessario, il codice liberamente disponibile può essere adattato per altri organismi e tipi di immagine. Segmentazione, tracking, e lignaggio algoritmi di assegnazione possono essere specifiche per i tipi di immagini assegnato e l'organismo in questione. Gli algoritmi esistenti potrebbero essere sostituiti, ma conservano ancora l'interfaccia grafica che permette l'ispezione di facile visiva e la correzione degli errori di segmentazione e monitoraggio che invariabilmente occupantir con qualsiasi algoritmo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo di cui sopra descrive un metodo semplice per ottenere e analizzare i dati di fluorescenza di serie storiche con limitata esperienza in microfluidica o nello sviluppo di software. Esso permette di ottenere in time-lapse film di fluorescenza di cellule di lievito singoli; estrarre dimensioni delle cellule pertinenti e misure di espressione; monitoraggio curato e assegnazioni lignaggio, e analizzare il comportamento delle cellule intere nel tempo utilizzando un dispositivo cultura microfluidica disponibili in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Emily Jackson, Joshua Zeidman, e Nicholas Wren per i commenti sul software. Questo lavoro è stato finanziato da GM95733 (a NM), BBBE 103316 e fondi di avvio del MIT (a NM).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Y04C Yeast Perfusion Plate | CellAsic | Y04C-02 | |
| ONIX Microfluidic Perfusion Platform | CellAsic | EV-262 | |
| Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | ||
| Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Cascade II EMCCD camera | Photometrics | ||
| Lumen 200 metal-halide arc lamp | PRIOR Scientific | ||
| Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set | Chroma Technology Corp | set #89006 | Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato) |
| MAC 5000 controller and filter wheels | Ludl Electronic Products | ||
| MATLAB R2011a | Mathworks | 64-bit version handles large data files better than 32-bit |
References
- Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. Signaling-mediated bacterial persister formation. Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).
- Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332 (6028), 472-474 (2011).
- Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).
- Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. , (2013).
- Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5 (9), e239 (2007).
- Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024 (2005).
- Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).
- Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3 (1), e1468 (2008).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).
- Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).
- To, T. -. L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).
- O’Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O’Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271 (5246), 209-212 (1996).
- Raser, J. M., O’Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).
