이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석

12.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50456

⸱

2013년 7월 18일

 , 
1Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology

이 논문에서

요약

우리는 형광 성장 효모 세포의 현미경 영화, 단일 셀 시계열 데이터를 추출하는 GUI 기반의 소프트웨어 패키지를 얻을 수있는 간단한 프로토콜을 제시한다. 분석은 자동화 혈통과 육안 검사 및 추적 데이터를 수동으로 큐 레이션과 통합 부문 시간 할당을 포함합니다.

초록

형광 시간 경과 현미경은 단일 세포 수준에서 많은 생물학적 과정의 연구에 강력한 도구가되고있다. 특히, 유전자 발현의 시간적 의존성을 묘사하는 영화는 규제의 역학에 대한 통찰력을 제공하지만, 단일 세포의 형광 영화를 획득하고 분석하는 많은 기술적 과제가있다. 우리는 여기에서 이러한 데이터를 생성하는 상업적으로 이용 가능한 미세 배양 장치를 사용하여 간단한 프로토콜 및 MATLAB 기반의 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 기반의 소프트웨어 패키지 형광 이미지를 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 소프트웨어 세그먼트와 트랙 세포는, 사용자가 시각적으로 데이터의 오류를 부젓가락 할 수 있도록, 자동으로 혈통과 분열 시간을 지정합니다. GUI는 또한 전체 셀 추적뿐만 아니라 첫 번째와 두 번째 유도체를 생산하는 시계열을 분석합니다. 소프트웨어는 S.를 위해 설계되었습니다 동안 cerevisiae의 그 모듈과 다양성은 그것에게 t을 허용해야몇 가지 수정을 다른 세포 유형을 공부하는 플랫폼 역할을 O를.

서론

유전자 발현의 단일 세포 분석은 유전자 조절의 여러 측면에 대한 우리의 이해를 발전한있다. 유동 세포 계측법 또는 현미경을 사용하여 형광 기자 표현식의 정적 스냅 샷은 단일 셀 표현의 분포에 대한 유용한 정보를 제공하지만, 역사와 직접적으로 유전자 발현 역학을 통보하는 데 필요한 시간 시리즈 데이터의 진화를 부족합니다. 형광 시간 경과 현미경 단일 세포 측정 및 그들의 역사를 모두 얻을 수있는 수단을 제공합니다. 다양한 실험 및 분석 기술은 따라서 이러한 휴대 전화의 변화 2,3, 세균 persister 형성 4, 전사 등의 유전자 조절 기능에 대한 통찰력을 (검토를 위해 1 참조) 부여, 형광 기자 식의 영화를 획득하고 정량화하기 위해 개발되었습니다 시작과 신장 5, 6,7 파열 전사, 세포주기 의존 8,9, 및 유전 10. 그러나 OBTaining 품질의 단일 세포 형광 시계열 배양에서 상당한 기술적 도전 제어 환경에서 획득 한 형광 영화의 높은 처리량 정량에있는 세포의 단일 층을 포함한다. 여기에, 우리는 S의 형광 영화를 획득하고 분석하는 절차를 설명 세포 배양 장치 제조 또는 소프트웨어 개발없이 필요한 경험 (그림 1) cerevisiae의.

첫째, 우리는 당신에게 세부 사항을 예를 들어 프로토콜을 하나 이상 형광 기자를 표현 신진 효모에 대한 형광 시계열 영화를 생성합니다. 사용자 정의 미세 배양 챔버를 구축하고 성공적으로 이전 11-13 사용되어 왔지만, 우리는 CellAsic (헤이워드, CA)에서 상업적으로 이용 가능한 미세 유체 장치를 사용하십시오. 시스템 경계 단층 성장 세포의 관류 환경을 지속적으로 제어 할 수 있습니다. 우리가 제시 현미경 프로토콜은 fluoresc를 얻을 수있는 간단한 방법입니다레퍼런스 신진 효모의 영화,하지만 수정 된 실험 프로토콜 (사용자 정의 문화 장치, 대안 미디어의 조건 등.) 단일 효모 세포의 유사 형광 동영상 데이터를 산출로 대체 할 수 있습니다.

다음으로, 우리는 시계열 데이터를 추출하는 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 기반 MATLAB에서 소프트웨어 패키지 (매스 웍스, 틱, MA), 형광 시계열의 신속한 분석 (이식)에 대한 GUI 별명을 사용하여 영화의 분석을 설명 단일 세포. 이식 세포를 분할 및 추적과 형광 강도 및 형상 정보를 추출에서 다양한 오픈 소스 소프트웨어 패키지 셀 ID (14)와 유사한 기능을 가지고 있습니다. 그러나 이식은 중요한 추가 기능을 제공합니다. 첫째, 세분화 및 데이터의 정확성보다는 분석 후 국외자 지역 트레이스 단지 통계 게이트를 확인하기 위해 추적 결과를 쉽게 대화 형 편집을 제공합니다. 또한, 그것은 automaticall에 분석을 확장Y 지명 한 계보와 신진 효모의 관심의 세포주기를 가리 킵니다. 어머니와 딸은 두 개의 독립적 인 셀 영역을 형성하기 위하여 분할하는 경우 결정하는 전체 세포 (연결된 새싹을 포함한 어머니) 세포주기 8에 걸쳐 측정을 결정하는 매우 중요합니다. 제품군은 이러한 작업을 수행하기 위해 3 개의 모듈로 구성되어 있습니다. 집중과 산만 시야 이미지 사이의 대비를 기반으로하며 첫 번째 세그먼트 셀 영역은 사용자가 분할 매개 변수를 정의하고 시각적으로 테스트 할 수 있습니다. 초 (.에서 제공 블레어 크로커 등 IDL 루틴 듀프 레인의 MATLAB 구현을 사용하여 : 트랙 http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ )과 시간을 통해 셀 영역을 측정, 자동 계보를 할당하고, 육안 검사를 수 및 오류 수정. 간단한 플로팅 GUI는 쿼리를 단일 셀 속성에 포함되어 있습니다. 세 번째 모듈은 꽃 봉오리 출현과 분열 티타늄을 돌린다MES, 및 전체 세포의 시계열 데이터뿐만 아니라 그들의 첫 번째와 두 번째 시간 미분을 (같이 9에서 설명)를 출력합니다. 분석 모듈은 선택의 통계 소프트웨어의 후속 연구를위한 공백으로 구분 된 텍스트 파일로 데이터를 출력합니다. 따라서, 패키지는 사용자가 그래픽 인터페이스를 통해 높은 품질의 시계열 데이터를 추출 할 수 있습니다. 우리는 세포주기 9의 함수로 하나의 신진 효모 세포에서 실시간 녹음 속도를 추정하기 위해이 방법을 사용했습니다. 모듈이 싹 트는 효모, 매개 변수 또는 최적화되어 있지만, 필요한 경우, 자유롭게 사용할 코드는 다른 생물 및 이미지 유형에 적용 할 수 있습니다. 분할, 추적, 혈통 할당 알고리즘은 할당 된 이미징 및 문제 유기체의 유형에 해당 할 수 있습니다. 기존의 알고리즘은 대체하지만 여전히 사용자 친화적 인 육안 검사와 분할의 보정 변함 occu 추적 오류를 허용하는 GUI 인터페이스를 유지 할 수어떤 알고리즘 연구.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 미세 유체 챔버에서 성장하는 단일 효모 세포의 형광 현미경 동영상을 얻을

  1. 갓 성장 플레이트의 세포와 1 ML SC 미디어 (2 % 포도당과 아미노산의 완전한 보완이 합성 정의 미디어) 접종하고, 30 ℃에서 롤러 드럼 ~ 16 시간 배양 밤새 배양 최종 OD 600nm의 조기 로그 단계 성장 ~ 0.1이다 문화 등 준비합니다.
  2. OD 600nm의 = 0.1 스타터 필요에 따라 문화와 신선한 테스트 튜브에서 자라지 1 ML을 추가 6-8시간을 희석. 이 microfluidic 장치에로드하는데 적절한 농도로 영양이 풍부한 정상 상태로 성장 세포를 제공합니다. (또는, 실험에 필요한 세포를 준비하는 데 필요한 절차 단계 1.1-1.2를 대체합니다.)
  3. CellAsic에서 Y04C 미세 배양 플레이트를 준비 배송 용액을 제거, 멸균 물 우물을 씻어하고, ONIX 관류 시스템 흐름을 사용하여채널을 플러시 5 분 10 PSI에서 우물 1-6를 통해 물. 그런 다음 10 초 (로드 채널이 훨씬 더 높은 유속이 별도로 플러시해야한다) 6 PSI에 잘로드 8의 흐름.
  4. 모든 우물에서 물을 제거하고 잘 8로드 셀의 입구에 250 μL SC 우물 1-6 단계와 1.2 문화의 50 μL로 교체합니다. (또는 다른 조건 사이의 전환을 요구하는 실험 입구 우물 1-6에서 원하는 미디어를 넣습니다.)
  5. 플레이트에 ONIX 매니 폴드를 밀봉하고, 잘의 시작 미디어를 들고 단지 입구에서 6 PSI 적어도 5 분 뒤에 2 분 동안 6 PSI에 입구 우물 1-6에서 흐르는하여 프라이밍 채널과 문화 챔버 시작 실험. 단계 1.7까지 지속적으로이 흐름.
  6. 실험 현미경을 준비합니다. 우리는 캐스케이드 II 백 조명 EMCCD 카메라 (배광, 투싼,​​ AZ)과 혈구 AXIO Observer.Z1 위드 현미경을 사용 루멘 200 메탈 할라이드 아크photobleaching에 방지하기 위해 10 % 감쇠 형광 여기에 대한 램프 (PRIOR 과학, 록클 랜드, MA). 여러 개의 형광 채널에 취득하는 데 필요한 스위칭 시간을 최소화하기 위해, 우리 부부 CFP, YFP 및 RFP에 적합한 여기 / 방출 필터 단일 트리플 대역 통과 이색 필터 큐브 (; 세트 89006 채도 기술 공사, 폭포, 버몬트 벨로 우스) 외부, 고속 스위칭 필터 휠 (Ludl 전자 제품, 노바 토, CA)에서 설정합니다.
  7. 목표 (필요한 경우, 우리는 혈구 계획 - 고차 색지움 63X/1.40 오일 DIC를 사용)에 침지 액 몇 방울을 배치하고 거꾸로 현미경의 무대에 안전하게 microfluidic 장치를 마운트합니다. 플레이트 실험을하는 단계에서 전혀 이동하지 않습니다 보장하는 것은 데이터 분석시 세포 추적을 향상시킵니다. 우리는 단순히 이동을 방지하기 위해 무대 산에 판을 테이프입니다.
  8. 임베디드 포지 중 하나를 사용하여 첫 번째 문화 챔버의 왼쪽 세 번째 (챔버의 높이가 최소입니다)에 초점TION 마커. 물론 미디어 입구에서 흐름을 끄고 셀 흐름은 5 초 파열 6 PSI에 잘 8로드. 세포 배양 챔버 주위를 보는 단계로 이동합니다. 원하는 세포 밀도가 달성 될 때까지 시간의 흐름과 압력을로드 증가하지만, 오버로드와 신선한 미디어 챔버를 들어 왼쪽 장벽을 막힘 방지.
  9. 또한 6 PSI에서 시작 미디어를 포함하는 미디어 입구에서 흐르는 시작합니다.
  10. MetaMorph (분자 장치, 서니 베일, 캘리포니아) 또는 기타 현미경 자동화 및 제어 소프트웨어, 시간이 지남에 따라 여러 단계의 위치에서 여러 이미지를 가지고하는 다차원 인수를 설정. 의 수와 시간 점 사이의 간격을 설정합니다. ~ 10 셀마다 여러 단계의 위치를​​ 선택합니다 (빨리 혼잡하게됩니다.) 우리는 일반적으로 각 각 시점에서 취득시 ~ 11 초 요구하는 최대 16 자리까지 5 분 간격 및 이미지를 사용합니다.
  11. 있도록 각 단계의 위치에서 각 시점의 일에 인수를 설정전자 프로그램 것이다; 취득 BF 투과광 시야 (BF) MetaMorph에 내장 된 자동 초점 방식 (초점 정확도를보다 제어를 제공 각 단계의 위치의 시작 부분에 사용자가 작성한 전표로 자동 초점을 구현)를 사용하여 이미지에 초점을 초점면 (FP)에 +1 μm의에서 이미지, FP (이미지 사이에 필요로 포커스를 변경하는 사용자가 작성한 저널을 사용) -4 μm의에 초점 BF (BFOOF) 이미지를 획득하고 하나를 그레이 스케일 인수 최소한의 photobleaching에 신속한 수집을 위해 최적화 된 설정을 사용하여 FP 각 형광 기자에 대한 이미지.
  12. 필요한 경우, 세포 배양 챔버의 공간에서 형광 리포터 배경 및 음영 보정 이미지를 얻을 수 있습니다.
  13. ONIX 제어 소프트웨어의 실험 흐름 프로그램을 준비합니다. 동시에 MetaMorph에서 수집 프로그램 ONIX 제어 소프트웨어 흐름 프로그램을 시작합니다.
  14. 실험의 끝에서, 유엔 수정형광 이미지 (필요한 경우), 선택적. STK 동영상 파일 (위치 1 등 만들기 BF, BFOOF, CFP, YFP 및 RFP 영화에 각 단계의 위치에서 각 이미지 채널에 대해. TIF 파일을 결합에도 배경 및 음영 ).

2. MATLAB에서 FormatData GUI를 사용하여 추적을위한 포맷 및 세그먼트 데이터 (그림 2)

  1. 데이터 입력 GUI를 열려면 MATLAB에서 FormatData.m 파일을 실행합니다. 상단에 지정하거나 데이터 디렉토리를 설정하는 이미지 파일이 들어있는 폴더로 이동 한 후 실험에 기록 된 데이터 유형과 이미지 파일을 지정하는 GUI를 사용합니다.
  2. 오른쪽으로 수행 할 분석 유형을 나타내는 "시간 경과"옆에있는 라디오 버튼을 선택합니다. "시간 경과"시간 시리즈 (예를 들어, 마이크로 유체 챔버에서 성장 세포의 동영상)로 이미지 시리즈를 처리합니다. "정적"인구 (예 : 여러 개의 이미지가 DIF에서 찍은에서 가져온 스냅 샷 집합으로 각 이미지 시리즈를 취급합니다단일 슬라이드 샘플에 ferent 위치). 이 이식 버전에서는 여러 위치에 대한 시간 경과 데이터가 있지만 각 위치에 대해 별도의 파일 (단계 2.14)로 처리 할 수​​ 있습니다.
  3. 프레임 내에서 명백한 세포의 움직임을 최소화하기 위해 영화에서 각 이미지를 이동하여 부정확 한 무대의 움직임을 보정 할 이미지를 등록 확인란을 선택합니다. 우리는 강력하게 크게 (나중에 수동 트랙 큐 레이션을 감소) 추적 개선 등이 권장하지만 이미지가 국경에서 이동 된 위치를 채우기 위해 임의의 "백색 잡음"픽셀 값을 추가합니다. 또한 단계 2.7에서 세그먼트 BF 이미지를 볼 후 또는 단계 2.13까지 어느 시점에서 선택 될 수있다.
  4. "데이터 채널"패널에서 "시야"확인란을 선택합니다. BF 이미지를로드 할 수있는 권리를 "선택"을 클릭합니다. *. TIF 파일을 선택, Shift 키를 누른 상태에서 하나의 동영상에 해당하는 모든 BF 이미지를 선택한 다음 "열기"를 클릭합니다. *. STK 파일의 경우, 단지 관심 BF 스택을 선택합니다. 이미지가 성공하는 경우완전히 인식, 파일 이름은 "인식 데이터"는 패널의 오른쪽에있는 팝업 메뉴에 나열됩니다. . * TIF 파일의 파일 이름 (- BF_t001 등을 수집하는 동안 순차적 이름으로 파일을 저장) 올바른 순서로 표시해야합니다.
  5. "시야 (초점)"확인란을 선택하고 오른쪽에있는 팝업 창에 표시됩니다 BFOOF 파일을로드하는 단계 2.4에서와 같이 "Select"(선택) 버튼을 사용합니다. (BFOOF 잘 63X 세그먼트에서 FP에 비해 BF -4 μM로 얻었다.)
  6. "셀 마스크"확인란을 선택합니다. "마스크 소스"패널에서 "세그먼트 BF"옆의 라디오 버튼을 선택합니다. 분할 GUI를 열려면 "매개 변수"버튼을 누르십시오. (또는,이 경우, BFOOF 영화가 필요하지 않습니다. 후자를 누르면 단계와 2.4에서와 같이 영화를 선택하여 "선택 마스크 파일"버튼 옆에있는 라디오 버튼을 선택하여 사전 분할 마스크 동영상을 선택하고, 2.8 단계를 건너 뛸 수 있습니다.)
  7. 다른 분할 매개 변수 (각각의 설명을 볼 수 있습니다 설정"매개 변수 설명")을 눌러 및 "테스트"(그림 3)를 클릭하여 분할 품질을 테스트하여 에드. 성공적으로 분할 영역은 마젠타 테두리가 녹색이어야합니다. 영화에서 여러 시간 지점을 확인하는 슬라이더를 사용하십시오. 분할이 만족되면 FormatData GUI로 분할 매개 변수를 반환하는 "완료"를 선택합니다.
  8. "색상 이미지"확인란을 선택합니다. 텍스트 편집 상자에서 첫 번째 형광 이미지 채널의 색 이름을 입력 한 다음 Enter 키를 눌러 "추가하고 선택"단계 2.4에서와 같이 컬러 파일을로드 할 수 있습니다. 색상 이름은 왼쪽에있는 목록 상자에 추가되고 파일 이름은 오른쪽에있는 테이블에 추가됩니다. 실수가 컬러 파일을로드 제 경우 왼쪽에있는 목록 상자에서 색 이름을 선택하고 파일을 제거하려면 "제거 색"을 클릭합니다. 각 색상 채널에 대해이 단계를 반복합니다.
  9. 추가 하위 영역 마스크 형광 색상 중 하나 (예 : 찬란 핵 → nucl에 따라 경우귀 지역의 마스크가) 필요한있다 "컬러 마스크"확인란을 선택합니다. 그렇지 않은 경우, 2.12 단계로 건너 뜁니다. "컬러 마스크 소스"패널에서 텍스트 편집 상자에 하위 영역 마스크 이름을 입력합니다. "컬러 마스크 소스"패널 (색은 6 단계에서 추가 된 필요)에서 팝업 메뉴에서 색상을 선택하고 GUI를 테스트 임계 값을 열고 "매개 변수"를 누릅니다.
  10. 자동 오츠의 방법 15을 사용하여 임계 값을 결정하고, 이미지가 임계 값 (그림 4) 이상 보존 영역을 강조 할 것 "자동 임계 값"버튼을 누르십시오. 임계 값을 수동으로 편집 상자를 사용하여 조정할 수 있습니다. 임계 값이 모든 시간 지점에 대한 적절한 확인하려면 스크롤 막대를 사용하십시오. 만족하면 FormatData GUI에 임계 값으로 돌아가려면 "완료"를 누르십시오.
  11. 밀어 선택한 컬러 이미지에 적용되는 임계 값 모듈을 사용하여 하위 영역 마스크를 생성하기 위해 "추가하기 그리고 세그먼트". 컬러 마스크 이름과 소스 관련 연구로, 왼쪽 표에 표시됩니다오른쪽 표에 나타나는 ecognized 파일 이름. (또는 눌러 "추가하고"미리 만든 하위 영역 마스크 파일을로드 할 수 있습니다.)
  12. 아래에서 지정하거나 저장 디렉토리로 사용하기 원하는 폴더로 이동합니다.
  13. : 이미지 (에서 사용할 수 프랑소와 Nedelec에 의해 개발 된 tiffread2.m 코드를 사용하여 파일을 읽고 "포맷 데이터"를 눌러 http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 , 프로세스 데이터 및 *를 생성) 지정된 폴더에있다. 매트 파일입니다. 이 파일은 ProcessTimeSeries GUI에 입력 될 것입니다.
  14. 각 단계의 위치에 대한 영화 세트에 대한 단계 2.4-2.13를 반복합니다.

3. ProcessTimeSeries GUI 및 큐 레이트 ID와 리니지 할당 (그림 5)와 함께 시간을 통해 트랙 세포 및 계보

  1. 추적 GUI를 열려면 MATLAB에서 ProcessTimeSeries.m 파일을 실행합니다. 개봉 후 다음 매개 변수를 설정합니다GUI :
    • "상공 회의소 높이"( "파일 I / O"패널 왼쪽 위) - 이것은 세포가 갇혀있는 챔버의 높이를 나타냅니다. 그것은 8에서와 같이 셀 지역의 주요 및 보조 축을 기준으로 3D 타원체로 세포 부피에 가깝게있는 제약 조건으로 사용됩니다.
    • "μm의 / 픽셀"(패널 "I / O를 파일") - 단면적과 부피는 각각 μm의 2 μm의 3에서 계산 될 수 있도록 이미지를 μm의 거리를 픽셀을 보정하는 변환 계수.
    • "필터 패널"(아래의 "파일 I / O"패널) - 설정 최소 마스크 정크 영역을 필터링 할 최대 변수 "영역"- 픽셀 영역 영역; "ECC"- 편심 계수 → 0으로 더 많은 원형 , "SF"- 형상 계수, → 1 등보다 원형.
  2. "파일 I / O"패널에서 "이미지로드"를 클릭하고 FormatData GUI하여 관심 출력 *. 매트 데이터 파일을 선택합니다. 지역 마스크 (및 하위 영역 마스크) 각 색상 채널에 적용됩니다, 다른 측정의 수는 (표 1) 만들어집니다. 데이터 파일은 저장됩니다. 이전 세션에서 ProcessTimeSeries에 파일을로드하는 경우 분석은 처음부터 다시 시작해야하는 경우 (, 그것을 요​​구합니다주의 :..이 이미 완료 모든 트랙의 큐 레이션을 삭제하고 FormatData GUI에서 신선한 것처럼 데이터를 처리 할 경우, 실수로 신속하게 덮어 쓰지 않도록 이전에 기획 *. 매트 파일을 방지하기 위해 MATLAB 명령 창에서 Ctrl + C를 누르십시오, 다시 시작됩니다.)
  3. 다음으로, 세포를 추적 할 수 있습니다. "트랙 셀"패널 ( "필터"패널 옆)에서 다음 매개 변수를 설정합니다 :
    • "최대 변위"- 세포가 다른 세포로 표시되기 전에 인접한 이미지 사이를 이동할 수있는 픽셀의 최대 거리. 높은 변위 알고리즘을 더 이동하는 세포를 차지할 수 있다는 것을 의미하지만, 그것은 또한 군중의 셀 영역을 일치의 복잡성을 증가시킨다. 우리는 (3 단계 참조 12에서 시작하여 오류 추적에 발생하면 감소.4).
    • "최소 길이"- 유효한 데이터 시리즈 고려해야 할 셀 추적에 대한 발생의 최소 개수. 우리는 실제 트레이스의 제거를 방지하기 위해 1을 사용하지만이 짧은, 스퓨리어스 영역 흔적 분할 결과 경우 증가 할 수 있습니다.
    • "프레임 메모리"- 연속 프레임의 최대 수를 셀 영역이 사라질 수하고 반환 할 때 동일한 ID를 부여. 그것은 "프레임 메모리"이상 사라지면, 그것은 반환에 새 ID를 받게 될 것입니다. 우리는 영역을 반환하기 전에 2 프레임의 분할에 의해 놓친 수 있도록 2를 사용하십시오.
  4. 지역 중심들을을 (: 블레어와 크로커의 듀프 레인 MATLAB 구현 그리어, 그리고 주 IDL 루틴에서 사용할 수를 사용하여 다음 단계로 하나의 프레임에서 영역을 추적 할 수있는 "트랙 셀"을 ​​클릭 http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) 새로 나오는 새싹에 대한 계보를 할당하고, 데이터를 저장 할 수 있습니다. 계보가 자동으로 분에 의해 할당 할 수 있습니다각 프레임에서 추정 새싹과 잠재적 인 어머니 사이의 거리를 imizing. (오류가 "어려운 조합론"에 의한 MATLAB 명령 창에 나타나면, "최대 배기량을"감소 및 추적을 반복한다.) 매개 변수를 변경하여 데이터의 필요에 따라 팝업 창합니다.
  5. 다양한 GUI 도구 또는 바로 가기 키 ( "선택된 셀 정보"패널 위의 버튼을 눌러 팝업 창에 표시)를 사용하여 제대로 분할 영역 및 ID 또는 계보 과제에서 실수를 큐 레이트.
    • 슬라이더, "이전 이미지", "다음 이미지"(Ctrl 키 + 왼쪽 / 오른쪽) - 표시 이미지 시리즈의 프레임 사이를 이동하는 데 사용합니다.
    • "이미지 #"는 - 왼쪽과 오른쪽 축에서 현재 이미지의 프레임 번호를 표시합니다. "# 이미지"편집 상자의 오른쪽에있는 해당 번호를 입력하여 특정 프레임으로 이동합니다.
    • "델타 프레임"- (- 왼쪽 Δ = 오른쪽) 오른쪽과 왼쪽 축 사이의 프레임 수의 차이를 보여줍니다.
    • (Ctrl 키 + T) "텍스트 숨기기"-의 셀 ID를 표시간에 전환오른쪽 축이나하지.
    • "숨기기 레이블"(Ctrl 키 + L) - 왼쪽 축 또는하지의 셀 ID를 표시 사이를 전환합니다.
    • "마스크"팝업 메뉴 - 더 마스크, 셀 마스크 또는 왼쪽 패널에 표시 할 사용자 정의 된 서브 마스크를 표시하지 사이에서 선택합니다.
    • "오버레이"팝업 메뉴 (Ctrl 키 1-9)는 - 왼쪽 프레임에있는 BF 및 색상 레이어를 표시하려면 선택합니다. 표시 BF는 두 축에서 BF 레이어를 켜거나 끄기 설정을 전환 한 것입니다. 다시 메뉴에서 오버레이 이름 ( "*"오버레이가 표시됩니다 의미)를 선택하여 표시 사이의 여부를 전환합니다. 2-9 순서로 색상 오버레이 전환에 CTRL +1 전환 BF 오버레이.
    • "설정 색상"- 오버레이 디스플레이 색상을 결정하는 데 사용합니다. 팝업 창 설정하는 형광 채널을 쿼리하고, 다음 색상 팔레트는 사용자 정의에 나타납니다.
    • 패널 "지역 및 트랙을 수정"- 이것들은 세포 영역 마스크 및 추적 정보에 대한 효과 변경 제어 :
      • "업데이트 트랙"(Ctrl 키 + U)는 - 다시 사용셀 ID를 지정합니다. 어떤 세포는 오른쪽 축에서 선택하지 않으면 셀 ID를 변경하려면, GUI는 메시지가 표시됩니다. ID X가 Y로 변경 될 때, X 이후의 모든 인스턴스는 Y로 변경되며, 현재 Y의 미래 인스턴스 (X.으로 전환됩니다 때때로 하나의 셀 반복, 2 ID 사이를 앞뒤로 전환합니다.이 오히려 업데이트 ID 함수에서 오류보다 oversegmented 지역에서 여러 ID를 수용하기 위해 노력하고 추적하기 때문입니다.) 여러 셀을 선택하고 해당 ID는 동시에 변경, 각에게 고유 한 ID를 제공해야 할 수 있습니다. 현재 파일에 존재하지 않는 ID에 영역을 할당하려면 "0"을 입력하고 하나가 생성됩니다. 두 강조 셀의 ID를 교환하기 위해 Ctrl 키 + W를 사용합니다.
      • "선택한 트랙 삭제"합니다 (Ctrl + D) - 현재 오른쪽 축 프레임에서 선택한 셀 또는 여러 셀 영역을 삭제하십시오. (어떤 셀이 선택되지 않은 경우, ID를 입력하라는 메시지를 표시합니다.) 영구적 ID 추적의 모든 인스턴스를 삭제하려면, 드 옆의 확인란을 선택LETE 선택된 트랙 버튼 (텍스트 "모두 삭제"로 변경됩니다.) 이 영구 정크 지역에 시달리지 유용하지만, 첫 번째 ID가 유효한 셀 또는 꽃 봉오리 영역에 전환되지 않도록하기 위해 미래의 프레임을 확인합니다.
      • "병합 영역"(Ctrl 키 + A 또는 M)는 - 셀 영역을 부드럽게하고 결합합니다. 선택 오른쪽 축 셀 (선택한 경우 영역이 빨간색으로 변합니다)를 클릭합니다. 한 지역에 병합 형태 학적으로 디스크 모양의 요소를 사용하여 균열 또는 작은 손실 덩어리를 기입 부근에 있습니다. 두 개 이상의 인근 지역을 병합 한 지역으로 그들을 결합하고 새로운 영역으로 낮은 ID를 제공합니다. 이 오버 분할 영역 (세포가 큰 액포가 종종 경우)에 유용합니다.
      • "지역 그리기"- 원하는 오른쪽 축에서 영역을 그리는 두 번 완료를 클릭하여 마우스를 사용합니다. 데이터 세트 (1 ~ 65535 사이)에 존재하지 않는 고유 한 ID를 제공합니다. 키보드의 삭제 키를 눌러 취소합니다.
    • "리니지 추적"패널 - 추적 한 후,계보 할당이 자동으로 생성됩니다. 새로운 ID 영역이 표시되면, 새로운 셀 ID가 분홍색으로 표시되고 빨간색 선은 어머니 영역에 그려집니다. 너무 큰 새로운 지역 봉오리거나 너무 멀리 잠재적 인 어머니에서 녹색으로 표시하고 "NaN이"( "숫자가 아님", 표 2 참조)의 어머니 ID를 할당합니다. 처음 점에서 기존의 지역 "0"어머니의 ID를 가지고 있습니다. 개별 과제를 해결하려면 텍스트 편집 필드에서 어머니와 새싹 ID를 입력하고 "수정"을 클릭합니다. 셀의 어머니를 지우려면, 그 어머니로 "0"을 입력합니다. 빠른 방법은 오른쪽 이미지의 두 영역을 선택하고 Ctrl 키 + F를 누르입니다 딸 셀에 대한 기존의 모든 어머니 할당을 삭제하는 동안이 자동으로, 딸​​과 어머니와 새로운 지역으로 이전 영역을 할당합니다. 주의 : 언제든지 "계보를 계산"클릭을 포함하여 계산 모든 계보 할당, 사용자가 이전에 기획했다합니다.
    • "선택한 셀 정보"패널 - "I에게 받기NFO "는 오른쪽 축에서 선택된 영역의 몇 가지 측정을 표시합니다."측정 "(데이터 내보내기"사용자가 어느 측정뿐만 아니라 다른 작업에 대한 기본 목록을 정의)이 표시됩니다 결정할 수 있습니다. "사용할 수 있습니다 올바른 ID와 계보 (예를 들어, 셀 X는 시간 t에서 새싹이있는 경우, 그것은 가능성이 가장 높은 시간 t에 다른 싹이 없습니다 + 5 분)을 결정합니다.
    • 업데이트 * 매트 파일을 사용자가 변경 사항을 반영하기 위해 -.합니다 (Ctrl + S) "변경 사항 저장"을 선택합니다. 자주 사용하는 (아무 기능을 취소 없음)!
    • "플롯 생성"- GeneratePlots GUI를 엽니 다. 빨리 ProcessTimeSeries GUI, 그들의 평균, 또는 각 프레임에있는 모든 지역의 평균의 오른쪽 축에서 강조 단일 셀 영역에 대한 선택 변수 정보와 간단한 계산을 그릴 때 사용합니다. 이 GUI는 거친 최초의 파생 상품을 계산하지만 왼쪽에 정확한 시간 간격을 지정해야 할 수 있습니다. 플롯은 "그림을 생성"버튼을 누르면 저장을위한 그림으로 출력 할 수 있습니다.
  6. 데이터를 제대로 보좌 신부하려면 : 모든 oversegmented 지역을 병합, 전체 셀을 캡처되지 않은 영역을 삭제할 어머니 봉오리 관계가 제대로 (빨간색 선이 꽃 봉오리 출현시 그 사이에 나타납니다 할당해야합니다, 새싹 ID가 분홍색 인 경우, 참조 표 2) 및, 지역에게 어머니를 할당 ID를 고정 어머니가를 ( "0"), 할당하거나 영역을 삭제하는 녹색 ID를 제거합니다. 그 어머니에게 꽃 봉오리 영역 (가 부정확 볼륨 추정으로 이어질 것) 병합하지 않도록 봉오리 데이터는 최종 분석하는 동안 어머니의에 추가됩니다.
  7. 시각적으로까지 관심의 마지막 시간을 각 프레임에 대한 데이터를 검사하지만, 나중에 프레임을 사용하지 않는 경우는 전체 시계열 필요하지 않습니다.
  8. 변경 사항을 저장해야합니다.
  9. 를 반복하여 각 단계의 위치를​​ *. 매트 파일에 대한 3.1-3.7 단계를 반복합니다.

4. 분석을위한 데이터 내보내기

  1. 단순히 팀을 통해 각 셀에 대해 원시 영역 측정을 내보내려면E, "데이터 내보내기"를 누릅니다. 그 측정이 열립니다 GUI에서 선택할 수 있습니다, 그들은 공백으로 구분으로 출력됩니다 *. TXT 열 헤더와 같은 변수 이름을 가진 파일입니다.
  2. 시간이 지남에 따라 전체 세포에 대한 시계열을 분석, 세포주기 정보를 계산하고 파생 상품을, "시계열 분석"을 누릅니다. 창은 관심과 분석 매개 변수를 입력 (그림 6)의 측정을 선택할 수 있도록 열립니다.
  3. GUI (이후의 모든 프레임은 무시됩니다)에서 큐레이터 마지막​​ 점을 입력합니다. 기본 부드럽게하고 세포주기 할당 매개 변수는 우리의 반수체 5 분 간격으로 몇 군데 배체 계통 위해 잘 작동하지만, 이러한 최상의 결과를 위해 변화해야 할 수 있습니다. (매개 변수 값을 수동으로 테스트 데이터 집합 신진과 분열 시간을 결정하고 자동화 된 알고리즘의 성능을 비교하여 적절한 지 확인하십시오.)
  4. 모든 매개 변수가 설정된 경우에 "분석"푸시 :
    1. 단점각 원시 측정을위한 배열을 truct와 배경 (각 형광 동영상의 첫 번째 프레임의 비 세포 영역의 평균 강도로 측정하거나, 세포 픽셀 당 평균자가 형광을 고려하여 지정 될 수 있습니다) 뺍니다.
    2. 고주파 측정 잡음 (로 9에서 설명) 제거하기 위해 선택한 측정에 부드럽게 스플라인을 맞 춥니 다.
    3. 자동 9에서 논의 볼륨 시계열의 기울기의 변화에 따라 각 셀에 대한 봉오리 출현 및 세포 분열 시간을 결정합니다. 새싹 측정 후 연속 전체 세포 시계열 출현과 나눗셈 각주기 사이에 어머니의 측정에 추가됩니다. 정규화 된 세포주기의 진행은 부문 부문에 0에서 2까지 계산됩니다.
    4. 안정적인 1 차 및 선택된 측정의 2 차 파생를 취할 스무딩 스플라인을 맞 춥니 다. (잘 정의 된 파생 상품, 시계열의 목적이전주기의 끝점을 충족하기 위해 다음과 같은 세포주기에 대한 데이터를 이동하여 부문에 걸쳐 지속됩니다.)
    5. 출력 각 측정 배열로 원시와 부드럽게 시계열 모든 지역에 대한, 그리고 전체 세포 부드럽게, 연속, 차별화 된 시계열. 첫 번째 요소는 배경 공제 컬러 인덱스, 첫 번째 행의 나머지는 셀 ID를 보유하고있는 첫 번째 열의 나머지 부분은 프레임 번호이고, 나머지 요소는 각 행과 열에있는 각 단일 셀에 대한 시계열 개최 첫 번째 열에는 프레임에 대응. 세포주기의 진행 시간 시리즈와 혈통 정보와 비슷한 배열도 출력됩니다. 배열은 "LineageArray은"어머니 ID, 새싹 ID, 첫 번째 꽃 봉오리 영역의 구조, 추정 신진 프레임 및 예상 분할 프레임입니다 다섯 번째 열을 통해 어머니 봉오리 관계의 첫 번째를 나타내는 각 행이있는 테이블이 포함되어 있습니다. 데이터는 *. 매트 파일 (MATLAB 데이터 파일)로 내보내집니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

성공적으로 수행하고 분석 실험은 현실적으로 할당 봉오리 출현과 분열 시간을 갖는 단일 전체 셀에 대한 대부분의 연속적인 시계열을 얻을 것입니다. 예를 들어, 우리는 성장과 글로벌 식 단세포 시간 (표 4, Y47에 다를 수 있습니다 방법을 관찰하기 위해 제정 ADH1 프로모터에 의해 구동 리안 형광 단백질의 통합 사본 (CFP)를 표현하는 반수체 효모 균주 위의 프로토콜을 수행 ). 우리는 시간이 지남에 따라 (그림 7A) 측정 전체 셀을 얻기 위해 시계열 분석을 실행하고, 9 발견 세포주기에 의존 볼륨과 표현 모두 나온다. 단백질 농도, 또는 평균 강도가 약간 (그림의 7B 및 7C) 감소하면서 봉오리 형성 한 후, 총 결합 된 볼륨 (어머니 + 새싹) (8,16와 일치) 더 빨리 봉오리 출현 이전보다 증가합니다. 결합 INTEGRA 상승테드 단백질 (이 경우 볼륨...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

위의 프로토콜은 마이크로 유체 또는 소프트웨어 개발에 대한 경험과 형광 시계열 데이터를 확보하고 분석하는 간단한 방법을 설명합니다. 그것은 하나의 단일 효모 세포의 시간 경과 형광 영화를 얻을 수 있습니다, 부목사 추적 및 계보 할당; 해당 셀 크기와 표현 측정을 추출하고 상업적으로 이용 가능한 미세 배양 장치를 사용하여 시간과 다양한 그래픽 사용자를 통해 전체 세포의 동작을 분석 인터페이스 (GUI). 실험, 분할 및 추적 단계는 다양한 방법으로 이전 11,13,14으로 접근하고 있지만, 위의 절차는 생물학 사회의 광범위한 집합에 이러한 기술에 더 쉽게 액세스 할 수 있도록 설계되었습니다. 위의 절차가 특정 미세 배양 장치에 최적화되어 있지만, 전반적인 분석은 저렴하고 더 정의가 기성 미세 배양 기술로 유사한 장치에 적용 할 수 있습니다. fundam을entally, 우리는 고용 분할 및 지역 측정 알고리즘은 기존의 방법 13,14 비슷하지만 이식 소프트웨어는 시각적 영역 추적 및 계보...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

우리는 소프트웨어에 대한 의견을 에밀리 잭슨, 여호수아 Zeidman, 그리고 니콜라스 렌 감사합니다. 이 작품은 GM95733 (NM)로, BBBE 103316와 MIT 시작 기금 (NM까지)에 의해 재정 지원되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Y04C 효모 관류 플레이트CellAsicY04C-02
ONIX 미세유체 관류 플랫폼CellAsicEV-262
Axio Observer.Z1 현미경Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objectiveZeiss440762-9904-000
Cascade II EMCCD 카메라광량
루멘 200 메탈 할라이드 아크 램프PRIOR Scientific
삼중 대역 통과 이색성 필터 큐브 및 여기 및 방출 필터 세트Chroma Technology Corp세트 #89006YFP(Venus/Citrine), CFP(Cerulean), RFP(mCherry/tdTomato)
MAC 5000 컨트롤러 및 필터 휠Ludl Electronic Products
MATLAB R2011aMathworks64비트 버전은 32비트보다 대용량 데이터 파일을 더 잘 처리합니다.
에 사용

참고문헌

  1. Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).
  3. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
  4. Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. Signaling-mediated bacterial persister formation. Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).
  5. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
  6. Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).
  7. Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332 (6028), 472-474 (2011).
  8. Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).
  9. Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. , Submitted (2013).
  10. Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5 (9), e239(2007).
  11. Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024(2005).
  12. Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).
  13. Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3 (1), e1468(2008).
  14. Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).
  15. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).
  16. Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).
  17. To, T. -L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).
  18. O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271 (5246), 209-212 (1996).
  19. Raser, J. M., O'Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

더 많은 논문 탐색

형광 타임랩스 현미경 검사미세유체 배양 장치GRAFTS 소프트웨어세포 추적계보 할당시계열 분석전사율유전자 발현 역학
신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.