Biosensori per il rilevamento di antibiotici batteri di stafilococco resistenti

Summary

Biosensori fagi litici e perline anticorpi sono in grado di discriminare tra resistente alla meticillina (MRSA) e batteri di stafilococco sensibili. I fagi sono stati immobilizzati con un metodo Langmuir-Blodgett su una superficie di un sensore microbilancia cristallo di quarzo e lavorato come larghe sonde stafilococco gamma. Perle di anticorpi riconoscono MRSA.

Abstract

Un batteriofago litico strutturalmente trasformato avere una vasta gamma di ospiti di ceppi di Staphylococcus aureus e di una proteina legante la penicillina (PBP 2a) anticorpi coniugati perle di lattice sono stati utilizzati per creare un biosensore progettato per la discriminazione di meticillino-resistente (MRSA) e sensibile (MSSA) S . specie aureus ^1,2. I fagi litici sono state convertite in sferoidi fagiche dal contatto con all'interfaccia acqua-cloroformio. Fago monostrati sferoidali sono stati spostati su una superficie biosensore da Langmuir-Blodgett (LB) tecnica ^3. I biosensori creati sono stati esaminati da una microbilancia cristallo di quarzo con il monitoraggio di dissipazione (QCM-D) per valutare le interazioni batteri-fagi. Interazioni batterio-sferoidali portato alla frequenza di risonanza ridotta e un aumento della dissipazione energetica per entrambi i ceppi MRSA e MSSA. Dopo il legame batterico, questi sensori sono stati ulteriormente esposta alla penicillina-binding protein anticorpo lattice tallones. Sensori analizzati con MRSA hanno risposto a PBP 2a perline anticorpi, anche se i sensori controllati con MSSA hanno dato alcuna risposta. Questa distinzione sperimentale determina una discriminazione univoca tra resistente alla meticillina e S. sensibile aureus. Altrettanto legati e non legati batteriofagi sopprimere la crescita batterica sulle superfici e nelle sospensioni idriche. Una volta che i fagi litici vengono trasformati in sferoidi, conservano la loro forte attività litica e mostrano un'elevata capacità di cattura batterica. Il fago e fago sferoidi possono essere utilizzati per il test e la sterilizzazione di microrganismi resistenti agli antibiotici. Altre applicazioni possono includere l'uso in terapia batteriofago e superfici antimicrobiche.

Introduction

Ceppi meticillino-resistenti di Staphylococcus aureus sono stati suggeriti come fattore di infezioni essenziali e le epidemie nosocomiali ^4-8. Modi comuni di riconoscimento di resistenza alla meticillina, come la diffusione oxacillina prova schermo agar disco, o brodo microdiluizione, affidano a condizioni di coltura su misura per migliorare l'espressione di resistenza. Alterazioni comprendono l'utilizzo di oxacillina, incubazione a 30 o 35 ° C invece di 37 ° C, e l'inclusione di NaCl al mezzo di crescita. Inoltre, per una corretta rilevazione da questi tipi di tecniche, un lungo periodo di incubazione di 24 ore anziché 16 a 18 ore è necessaria. Tecniche rapide con appropriato livello (> 96%) di sensibilità per l'identificazione di resistenza alla meticillina comprendono tecniche microdiluizione automatici come il Vitek GPS-SA card, il sistema Rapid ATB stafilococco, e il sistema pannello Rapid Microscan che producono risultati dopo 3-11 ore ^9-11. The Crystal MID sistema RSA è un metodo rapido basato sul riconoscimento della crescita di S. aureus in presenza di 2% di NaCl e 4 mg di oxacillina per litro con un sensore di fluorescenza sensibili all'ossigeno. Sensibilità rivendicati variano tra il 91 e il 100% dopo 4 ore di incubazione di ^12-14. Questi metodi fenotipici limita le precisioni dall'impatto di ceppi prevalenti che esprimono resistenza eterogenea. Pertanto, i metodi più ampiamente accettato per il riconoscimento della resistenza alla meticillina è PCR o ibridazione DNA del gene mecA ^15. Tuttavia questa tecnica richiede DNA purificato ed è estremamente sensibile a vari additivi (impurità), che includono cellule detriti ^16.

Inoltre, queste tecniche hanno bisogno di molto tempo per eseguire. Strategie per il riconoscimento del prodotto del gene mecA, proteina PBP 2a, potrebbero essere utilizzati per determinare la resistenza e possono essere più affidabile rispetto alle tecniche di prova standard ^17.

<p class = "jove_content"> Era stato precedentemente dimostrato che batteriofago 12600 può essere utilizzato come sonda di riconoscimento per i ceppi di Staphylococcus aureus compresi quelli aventi resistenza alla meticillina ^1,2,18. In questo lavoro abbiamo proposto una nuova tecnica nel riconoscimento specifico e la rilevazione di MRSA, come ad esempio il riconoscimento di batteri con conformazione di MRSA in tempo reale. Per questo scopo specifico di una S. batteriofago aureus con un ampio spettro di ospiti (tra cui i ceppi di MRSA) in combinazione con anticorpi monoclonali contro la proteina (PBP 2a) sono stati utilizzati. PBP 2a è una proteina della parete cellulare ed è la causa di antibiotico resistività di MRSA. Tuttavia PBP 2a anticorpo non è specifico per S. aureus da altri batteri sono proteine ​​leganti antibiotici con similarità di sequenza di PBP 2a ^19,20. Di conseguenza, in questo lavoro, S. aureus batteriofago e anticorpi contro proteine ​​PBP 2a sono stati utilizzati. Per essere in grado di sviluppare un biosensore per specificamente rilevare e identificare MRSA un dispositivo con un due stadi è stato utilizzato. Il passo iniziale utilizzato un S. aureus batteriofago monostrato come sonda sensore, mentre la seconda fase impiega anticorpi specifici PBP 2a. Pertanto, passo uno riconosceranno S. aureus batteri, come l'altra saranno sensibili alla proteina antibiotico-binding. Quando i segnali ricevuti da due passi sono positivi, indica il rilevamento specifico di MRSA.

Protocol

1. Ponendo le basi Ottenere tipo ceppo S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 e di Bacillus subtilis ATCC 6051. Ceppi meticillino-resistenti di S. aureus – MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; Il fago litico 12600. Ottenere PBP 2a anticorpi coniugati perle di lattice. …

Representative Results

Il fago dimostrato attività litica contro tutti i ceppi testati di S. aureus, compresi i ceppi di MRSA, come indicato dallo spot test fago. Dimensioni della placca in genere variavano da 5 a 15 mm. Nessuna attività è stata trovata contro altri test-culture (Tabella 1). Una crescita normale di S. aureus ATCC 12600 in terreno NZY on-agitatore incubatore a 37 ° C è mostrata nella Figura 1A (una curva etichettato da cerchi vuoti). Il numer…

Discussion

E 'noto che i fagi possono essere usati come sonde biosensore per patogeni batterici ^28. Si dimostra in questo lavoro che fago insieme con anticorpi PBP 2a può essere utilizzata per risolvere il vecchio problema: ceppi resistenti e sensibili agli antibiotici discriminazione rapidi.

Si è riscontrato però quelle normali fagi stafilococciche non modificate non sono adatti al rilevamento batteri con i dispositivi QCM, anche se si legano batteri. La coda fago è così lunga che …

Materials

			Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
spectrophotometric-grade chloroform	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
			Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600	The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance	KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden	E4
Scanning electron microscope (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish	NUNC A/S, Denmark	240835	Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Gold-coated quartz pieces	Auburn University, AL		Homemade
Petri dishes	Fisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer	Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.	4001
Plasma Cleaner	Harrick Plasma, USA	PDC-32G
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Sweden	QSoft, QTools