प्रारंभिक भोजी घटनाक्रम की सेल इमेजिंग लाइव: Omegasomes और परे
Summary
Fluorescently लेबल भोजी मार्करों के समय चूक माइक्रोस्कोपी उच्च अस्थायी समाधान के साथ गतिशील भोजी प्रतिक्रिया की निगरानी की अनुमति देता है. 3 अलग अलग रंगों के संयोजन में विशिष्ट भोजी और organelle मार्कर का उपयोग करना, हम एक मजबूत स्थानिक और लौकिक संदर्भ में autophagosome गठन के लिए एक प्रोटीन के योगदान का पालन कर सकते हैं.
Abstract
भोजी विशेष रूप से पोषक तत्वों, एमिनो एसिड के अभाव की कमी से चालू होने वाले एक सेलुलर प्रतिक्रिया है. भोजी कोशिका द्रव्य, लंबे समय रहते प्रोटीन और भी प्रोटीन समुच्चय, दोषपूर्ण organelles है, और वायरस या बैक्टीरिया पृथक कि autophagosomes बुलाया डबल झिल्ली संरचनाओं के गठन, द्वारा परिभाषित किया गया है. Autophagosomes अंततः उत्पादन पोषक तत्वों कोशिका द्रव्य को वापस पुनर्नवीनीकरण किया जा रहा है, उनकी सामग्री के थोक गिरावट के लिए अग्रणी लाइसोसोम के साथ फ्यूज. इसलिए, भोजी सेल homeostasis के लिए महत्वपूर्ण है, और भोजी की अनियंत्रण रोग, सबसे विशेष रूप से neurodegeneration, उम्र बढ़ने और कैंसर को जन्म दे सकता है.
Autophagosome गठन कोशिकाओं कोर भोजी मशीनरी नामक प्रोटीन की एक विशिष्ट समूह, आवंटित की है, जिसके लिए एक बहुत विस्तृत प्रक्रिया है. कोर भोजी मशीनरी कार्यात्मक, विविध सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल अतिरिक्त प्रोटीन से पूरित membran में जैसे हैmitochondrial और लाइसोसोमल जीव विज्ञान में ई तस्करी,. Autophagosomes के गठन और गिरावट के लिए इन प्रोटीनों का समन्वय भोजी की अत्यधिक गतिशील और परिष्कृत प्रतिक्रिया का गठन किया. लाइव सेल इमेजिंग एक एक एकल autophagosome गठन घटना के स्तर पर प्रत्येक भोजी से संबंधित प्रोटीन की आणविक योगदान नीचे का पालन करने की अनुमति देता है और वास्तविक समय में है, इसलिए इस तकनीक का एक उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प प्रदान करता है.
यहाँ हम हमारे विश्लेषण के लिए एक स्थानिक और लौकिक संदर्भ स्थापित करने के लिए, स्थिरतापूर्वक GFP-DFCP1 व्यक्त एक सेल लाइन का उपयोग करें. Autophagosomes गठन के लिए अग्रणी अग्रदूत संरचनाओं हैं जो DFCP1 निशान omegasomes,. ब्याज (POI) के एक प्रोटीन एक लाल या सियान फ्लोरोसेंट टैग किसी के साथ चिह्नित किया जा सकता है. माइटोकांड्रिया और लाइसोसोम ईआर तरह अलग organelles,,, सभी autophagosome गठन के विभिन्न चरणों में शामिल किया जाता है, और एक विशेष नजर रखने डाई का उपयोग कर के रूप में चिह्नित किया जा सकता है. Autop के समय चूक माइक्रोस्कोपीइस प्रयोगात्मक सेट अप में hagy, सूचना चौथे आयाम, यानी समय के बारे में निकाला जा सकता है. इसलिए हम अंतरिक्ष और समय में भोजी को POI के योगदान का पालन कर सकते हैं.
Introduction
भोजी 1-3 autophagosome गठन के अंतिम परिणाम के लिए प्रोटीन की एक बड़ी संख्या के समन्वय की आवश्यकता है जो एक अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है. माइक्रोस्कोपी शायद सबसे अधिक भोजी 4 के अध्ययन के लिए लागू किया जाता तकनीक है. सबसे भोजी प्रोटीन का स्थानीयकरण बड़े पैमाने पर दोनों अंतर्जात प्रोटीन इम्युनो धुंधला करके और fluorescently टैग एक्सोजेनस प्रोटीन की अभिव्यक्ति के द्वारा, निर्धारित कक्षों में अध्ययन किया गया है. इसके अलावा, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम), अकेले और इम्युनो सोने की लेबलिंग, के साथ संयोजन में इन संरचनाओं 5,6 के ठीक विवरण का वर्णन किया गया है. समय – इन तकनीकों अंतरिक्ष के 3 आयामों में autophagosome गठन के बारे में हमारी समझ की स्थापना की है कि इस तथ्य के बावजूद, वे 4 वें आयाम के बारे में जानकारी के लिए पर्याप्त राशि उपलब्ध कराने में नाकाम रहे हैं. यह possi के रूप में बंद के रूप में एक autophagosome के गठन के बाद की अनुमति देता है के रूप में लाइव सेल इमेजिंग इस बाधा पर काबूवास्तविक समय 7 से ble. यह तकनीक पहले Yoshimori और उनके सहयोगियों ने 8 से भोजी अध्ययन करने के लिए नियुक्त किया गया था, और तेजी से आगे से इस्तेमाल किया गया है.
समय चूक माइक्रोस्कोपी जीवित कोशिकाओं में POI का और समय की अवधि में स्थानीयकरण कब्जा. एक अच्छी तरह से विशेषता भोजी और / या organelle मार्कर के साथ इस जानकारी की तुलना करके, जीना सेल इमेजिंग विश्लेषण autophagosome गठन का अधिक से अधिक स्थानिक और लौकिक संदर्भ में POI को रख सकते हैं. लाइव सेल इमेजिंग विश्लेषण autophagosome गठन के सभी चरणों के साथ POI के स्थानीयकरण का दोहराव कैप्चरिंग पर आधारित है, तय कोशिकाओं की इमेजिंग एक भी कब्जा पर आधारित है, जबकि. तय कोशिकाओं की इमेजिंग केवल उनके lifecy के विभिन्न चरणों में एक साथ कब्जा कर कई autophagosomes में इसकी औसत स्थानीयकरण पर आधारित POI की भूमिका ग्रहण कर सकते हैं, जबकि इसलिए, जीना सेल इमेजिंग, autophagosome गठन के विशिष्ट चरणों में POI के योगदान को साबित कर सकते हैंcle.
जीना सेल इमेजिंग उच्च विश्लेषणात्मक शक्ति की एक विधि है, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए जो कुछ निहित सीमाओं है. सबसे पहले, जीना सेल इमेजिंग एक या एक से अधिक एक्सोजेनस fluorescently लेबल प्रोटीन की अभिव्यक्ति की आवश्यकता है. फ्लोरोसेंट टैग आकार में बड़े हो जाते हैं और वे कभी कभी steric कारणों की वजह से एक प्रोटीन के व्यवहार को बदल सकते हैं. वे झिल्ली के 2 आयाम के सीमित स्थान में कार्य की आवश्यकता के रूप में यह स्थिति, झिल्ली प्रोटीन के लिए बढ़ रहा है. ध्यान से, autophagosomes झिल्लीदार संरचनाओं हैं, और उसके अनुसार अपने गठन झिल्ली से जुड़े प्रोटीन की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है.
समस्याओं का एक और सेट POI की अभिव्यक्ति के स्तर से जुड़ा है. सिद्धांत रूप में, एक exogenous प्रोटीन अंतर्जात प्रोटीन के लिए तुलनीय स्तर पर व्यक्त की जानी चाहिए. यह अपने उप सेलुलर स्थानीयकरण की महत्वपूर्ण नियामकों संतृप्त नहीं किया जाएगा कि यह सुनिश्चित करता है, और वेंई विश्लेषण जैविक प्रासंगिक हो जाएगा. वे अंतर्जात स्तर से ऊपर व्यक्त कर रहे हैं, जब वे भोजी प्रतिक्रिया 9 को बाधित करते हैं इसके अलावा, भोजी प्रोटीन की overexpression, बचा जाना चाहिए. इसके विपरीत, POI की अभिव्यक्ति के स्तर के बाद से तस्वीर विरंजन के बिना समय का एक अच्छा अवधि के लिए अपनी स्थानीयकरण निम्नलिखित अनुमति देने के लिए पर्याप्त उच्च किया जाना चाहिए, एक समझौते पर पहुंच जाना है. Mammalians कोशिकाओं में एक exogenous प्रोटीन का इष्टतम अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के ठीक ट्यूनिंग की बहुत आवश्यकता है, लेकिन यह स्थिरतापूर्वक POI के विभिन्न स्तरों व्यक्त सेल लाइनों की स्थापना और स्क्रीनिंग के द्वारा संभव है.
मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त किया जा सकता है कि स्थानिक संकल्प एक और सीमित कारक है. संकल्प कारणों की एक संख्या के लिए सीमित किया जा सकता है, लेकिन सबसे अच्छे रूप में, पार्श्व संकल्प 250 एनएम के आसपास होगी. यह इस से छोटी एक दूरी से अलग किसी भी वस्तु (या किसी भी रूप में जुड़ा हुआ दिखाई देगा कि इसका मतलबवस्तु) और 250 एनएम से छोटी वस्तुओं वे वास्तव में कर रहे हैं से भी बड़ा छवि में प्रतिनिधित्व किया जाएगा. इसलिए छवियों हमेशा मन में इस के साथ व्याख्या की जानी चाहिए और इस तरह के ईएम के रूप में पूरक तकनीकों ठीक अल्ट्रा संरचनात्मक विस्तार से हल करने के लिए आवश्यक हो जाएगा.
अंत में, जीना सेल इमेजिंग स्वाभाविक समय की एक लम्बी अवधि के लिए संभावित, प्रकाश के लिए एक सेल को प्रकाश में लाने की आवश्यकता है. यह एक सेल, फोटो विषाक्तता के रूप में जाना जाता घटना की शारीरिक प्रतिक्रियाओं को बदल सकता है.
हम सफलतापूर्वक autophagosomes ईआर किस्में 10,11 के साथ निकट सहयोग में हैं जो PI3P युक्त अंगूठी संरचनाओं की तरह करार दिया omegasomes, कि आरंभ से पहली बार के लिए का वर्णन करने के PI3P बाध्यकारी प्रोटीन DFCP1 का जीना सेल इमेजिंग का इस्तेमाल किया है. हम स्पष्ट रूप से LC3 पॉजिटिव संरचनाओं omegasomes के साथ निकट सहयोग में बनाने शुरू कर दिखाया है. हम यहाँ एक सेल लाइन को रोजगार स्थिरतापूर्वक जीवित कोशिका के लिए GFP-DFCP1 व्यक्त करने का सुझाव है किब्याज की प्रोटीन की इमेजिंग, autophagosome गठन में अपनी भूमिका के लक्षण वर्णन के लिए एक मजबूत स्थानिक और लौकिक फ्रेम स्थापित करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि autophagosome गठन के दौरान एक प्रोटीन के स्थानीयकरण के दृश्य की अनुमति देता है. हम घटनाओं डिस्क confocal और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी कताई, बिंदु स्कैनिंग confocal स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हमारा काम जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित है. हमारा अनुरोध है कि पाकिस्तानी-LC3 की अभिव्यक्ति के लिए प्लाज्मिड के साथ हमें आपूर्ति के लिए प्रोफेसर Tamotsu Yoshimori धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41965 | |
| OptiMEM I | Invitrogen | 31985-062 | |
| MitoTracker Red FM | Invitrogen | M22425 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 | |
| X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche Applied Science | 6365787001 | |
| 22 mm coverslips | VWR | 631-0159 | |
| 35 mm plates | Fisher NUNC | 153066 | |
| Silicon grease | RS Components Ltd. | RS 494-124 | |
| O-rings | Custom made | ||
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A-7816 | Suggested alternative to custom-made O-rings |
| Microscope | Olympus | IX81 | Inverted microscope |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 100XO | N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5 |
| Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600 10B | Progressive scan interline CCD |
| Illuminator | TILL Photonics | Polychrome V | Ultrafast monochromator |
| Incubation chamber | Solent Scientific | Cell^R IX81 | |
| Software | Olympus | SIS xcellence |
References
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