Vivre imagerie cellulaire de l'autophagie premiers événements: Omegasomes et au-delà
Summary
Microscopie time-lapse de marqueurs de l'autophagie marquées par fluorescence permet le suivi de la réponse de l'autophagie dynamique avec une haute résolution temporelle. Utilisation de l'autophagie spécifique et marqueurs organites dans une combinaison de 3 couleurs différentes, nous pouvons suivre la contribution d'une protéine à la formation autophagosome dans un contexte spatial et temporel robuste.
Abstract
Autophagy est une réponse cellulaire déclenchée par le manque de nutriments, en particulier de l'absence d'acides aminés. Autophagy est définie par la formation de structures à double membrane, appelée autophagosomes, qui séquestrent cytoplasme, des protéines à vie longue et des agrégats de protéines, des organites défectueux, et même les virus ou les bactéries. Autophagosomes finalement fusionnent avec les lysosomes entraînant une dégradation majeure partie de leur contenu, les éléments nutritifs produits recyclés vers le cytoplasme. Par conséquent, l'autophagie est essentielle pour l'homéostasie cellulaire, et des dérèglements de l'autophagie peut conduire à la maladie, notamment la neurodégénérescence, le vieillissement et le cancer.
Autophagosome formation est un processus très complexe, pour lequel les cellules ont alloué un groupe spécifique de protéines, appelées les machines de l'autophagie de base. Le mécanisme de l'autophagie de base est complété par des protéines fonctionnellement supplémentaires impliquées dans divers processus cellulaires, par exemple dans membrane trafic, en biologie mitochondriale et lysosomale. La coordination de ces protéines pour la formation et la dégradation des autophagosomes constitue la réponse très dynamique et sophistiqué de l'autophagie. Imagerie de cellules vivantes permet de suivre la contribution moléculaire de chaque protéine autophagie liée vers le bas au niveau d'un seul événement de formation autophagosome et en temps réel, par conséquent, cette technique offre une résolution temporelle et spatiale.
Ici, nous utilisons une lignée cellulaire exprimant de façon stable GFP-DFCP1, d'établir un contexte spatial et temporel pour notre analyse. DFCP1 marques omegasomes, qui sont des structures précurseurs conduisant à la formation de autophagosomes. Une protéine d'intérêt (POI) peut être marqué d'une croix rouge ou marqueur fluorescent cyan. Différents organelles, comme la ER, les mitochondries et les lysosomes, sont tous impliqués dans les différentes étapes de formation autophagosome, et peuvent être marqués en utilisant un colorant de traçage spécifique. Microscopie time-lapse de autophagy dans ce dispositif expérimental, permet aux informations d'être extrait de la quatrième dimension, c'est à dire le temps. Ainsi, nous pouvons suivre la contribution du POI à l'autophagie dans l'espace et le temps.
Introduction
L'autophagie est un processus très dynamique, ce qui nécessite la coordination d'un grand nombre de protéines pour le résultat final de formation autophagosome 1-3. La microscopie est probablement la technique la plus couramment utilisée pour étudier l'autophagie 4. La localisation de la plupart des protéines autophagie a été étudiée dans des cellules fixées, tant par immuno-coloration des protéines endogènes et par l'expression de protéines marquées par fluorescence exogène. En outre, la microscopie électronique (EM), seul et en combinaison avec l'étiquetage immuno-or, a décrit les détails les plus fins de ces structures 5,6. Malgré le fait que ces techniques ont mis en place notre compréhension de la formation autophagosome dans les 3 dimensions de l'espace, ils n'ont pas réussi à fournir une quantité suffisante d'informations sur la 4 ème dimension – le temps. Imagerie des cellules vivantes surmonte cet obstacle car il permet de suivre la formation d'un autophagosome aussi proche que possibleble en temps réel 7. Cette technique a été employée la première à étudier l'autophagie par Yoshimori et ses collègues 8, et a été de plus en plus recours à l'avenir.
Microscopie time-lapse capte la localisation du point d'intérêt dans des cellules vivantes et sur une période de temps. En comparant ces informations avec un autophagie bien caractérisé et / ou organite marqueur, l'analyse de l'imagerie des cellules vivantes peut mettre le POI dans le contexte spatial et temporel plus élevé de formation autophagosome. Analyse d'imagerie de cellules vivantes sont basées sur la saisie répétitive de la localisation de points d'intérêt le long de toutes les étapes de la formation autophagosome, tandis que l'imagerie de cellules fixées sont basées sur une seule prise. Par conséquent, imagerie des cellules vivantes peut prouver la contribution du POI à des étapes spécifiques de formation autophagosome, tandis que l'imagerie des cellules fixes ne peut assumer le rôle de POI, en fonction de sa localisation moyenne dans de nombreux autophagosomes capturées simultanément à différents stades de leur lifecycle.
Bien que l'imagerie des cellules vivantes est une méthode de puissance analytique de haut, il a quelques limitations inhérentes, qui devraient être prises en considération. Tout d'abord, l'imagerie de cellules vivantes nécessite l'expression d'une ou plusieurs protéines marquées par fluorescence exogène. Marqueurs fluorescents ont tendance à être de grande taille et ils peuvent parfois modifier le comportement d'une protéine pour des raisons stériques. Cette situation est accentuée pour des protéines membranaires, comme ils ont besoin pour fonctionner dans l'espace limité des 2 dimensions de membranes. Fait à noter, autophagosomes sont des structures membraneuses, et en conséquence leur formation nécessite un grand nombre de protéines associées à la membrane.
Une autre série de problèmes est lié aux niveaux d'expression de la PI. En principe, une protéine exogène doit être exprimée à des niveaux comparables à la protéine endogène. Cela garantit que les régulateurs importants de sa localisation sub-cellulaire ne seront pas saturés, et eanalyse des e sera biologiquement pertinent. En outre, la surexpression de protéines autophagie doit être évitée, car quand ils sont exprimés au-dessus des niveaux endogènes, ils ont tendance à inhiber la réponse autophagie 9. En revanche, puisque les niveaux d'expression de la POI doit être suffisamment élevé pour permettre de suivre sa localisation pour une bonne période de temps sans photo-blanchiment, un compromis doit être atteint. Atteindre les niveaux d'expression optimale d'une protéine exogène dans les cellules mammifères nécessite beaucoup de réglage fin, mais il est possible en établissant et de criblage des lignées cellulaires exprimant de façon stable différents niveaux du POI.
La résolution spatiale qui peut être réalisé avec la microscopie à fluorescence standard est un autre facteur limitant. Résolution peut être limitée à un certain nombre de raisons, mais, au mieux, la résolution latérale sera autour de 250 nm. Cela signifie que tous les objets séparés par une distance inférieure à ce apparaîtront connecté (ou comme une seuleobjet) et des objets plus petits que 250 nm seront représentés dans l'image plus grande que ce qu'ils sont réellement. Par conséquent images doivent toujours être interprétés avec cela à l'esprit et des techniques complémentaires telles que l'EM seront nécessaires pour résoudre les petits détails ultra-structurelle.
Enfin, l'imagerie de cellules vivantes nécessite intrinsèquement exposition d'une cellule à la lumière, éventuellement pendant une période de temps prolongée. Cela peut modifier les réponses physiologiques d'une cellule, un phénomène connu sous le nom de photo-toxicité.
Nous avons utilisé avec succès imagerie des cellules vivantes de la protéine PI3P contraignant DFCP1 de décrire pour la première fois que autophagosomes proviennent de PI3P riches en structures en forme d'anneau omegasomes appelés, qui sont en étroite association avec ER brins 10,11. Nous avons clairement montré que les structures LC3-positifs commencent à se former en association étroite avec omegasomes. Nous suggérons ici que l'utilisation d'une lignée cellulaire stable exprimant la GFP-DFCP1 pour la cellule en directimagerie de la protéine d'intérêt, établit un cadre spatial et temporel robuste pour la caractérisation de son rôle dans la formation autophagosome.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite dans ce protocole permet la visualisation de la localisation d'une protéine pendant la formation autophagosome. Nous avons essayé différentes méthodes de visualisation des événements décrits, y compris point confocale à balayage, la filature disque confocale et Total Internal Reflection Fluorescence de la route (FRBR) de microscopie. Nous avons constaté que pour les fins générales de norme à grand champ épi-fluorescence offre le meilleur compromis entre la sensibilité et la résolu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Notre travail est soutenu par la biotechnologie et du Conseil de recherche en sciences biologiques. Nous tenons à remercier le Professeur Tamotsu Yoshimori de bien vouloir nous fournir avec le plasmide pour l'expression de la CFP-LC3.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41965 | |
| OptiMEM I | Invitrogen | 31985-062 | |
| MitoTracker Red FM | Invitrogen | M22425 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 | |
| X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche Applied Science | 6365787001 | |
| 22 mm coverslips | VWR | 631-0159 | |
| 35 mm plates | Fisher NUNC | 153066 | |
| Silicon grease | RS Components Ltd. | RS 494-124 | |
| O-rings | Custom made | ||
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A-7816 | Suggested alternative to custom-made O-rings |
| Microscope | Olympus | IX81 | Inverted microscope |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 100XO | N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5 |
| Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600 10B | Progressive scan interline CCD |
| Illuminator | TILL Photonics | Polychrome V | Ultrafast monochromator |
| Incubation chamber | Solent Scientific | Cell^R IX81 | |
| Software | Olympus | SIS xcellence |
References
- Mizushima, N. Autophagy: process and function. Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of Atg proteins in autophagosome formation. Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).
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- Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. 3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum. Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).
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- Mizushima, N., et al. Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells. The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).
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