최근 몇 년 동안 체외 배양 방법에서 사용하는 생식 세포의 형성은 체세포 줄기 세포의 여러 가지 유형을 사용하여 증명되었습니다. 이 문서에서는 시각적으로 초기 난 모세포 - 유사 세포로 신생아 마우스 유래 줄기 세포의 분화를 발표 할 예정이다.
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이 논문에서
요약
초록
생식 세포의 형성과 분화를 연구하는 것은 전통적으로 낮은 세포 수 및 개발 배아에서 깊은 자신의 위치로 인해 매우 어려운 일이다. 체외 기반 시스템에서 "폐쇄"의 여부는 배우자 형성에 대한 우리의 이해를 위해 매우 유용 할 수 있습니다. 신생아 마우스 피부에서 고립 된 체세포 줄기 세포에서 난자 세포와 같은 (OLCs)의 형성이 입증되었으며,이 비디오 프로토콜 시각화 할 수 있습니다. 결과 OLCs는 OCT4, 바사, Bmp15 및 Scp3으로 난자와 일치 다양한 마커를 표현한다. 그러나, 그들은 성숙 또는 감수 분열을 완료하는 데 오류로 인해 수정을받을 수없는 남아 있습니다. 이 프로토콜은 더 성숙한 배우자로 생식 세포의 초기 형성과 분화를 연구하는 데 유용 시스템을 제공합니다. 초기 분화 OCT4을 표현하는 세포의 수 (잠재적 인 생식 세포와 같은)하지만 현재 F를 ~ 5 %에 도달OLCs의 ormation은 상대적으로 비효율적 남아있다. 특별한주의가 시작 세포 인구가 건강하고 초기 통로이다 않도록주의해야하지만 프로토콜은 비교적 똑바로 앞으로이다.
서론
초기 배아 발생 동안, 배우자 형성은 원시 생식 세포 (PGC) 형성, 마이그레이션 및 생식 능선의 마지막으로 식민지 등 일련의 단계를 통해 발생합니다. 이 시간 동안 PGCs는 점점 더 성숙 배우자 1에 증식과 분화를 겪는다. PGCs는 배아 hindgut에 allantois의 기지에서 마침내 결국 생식 능선을 식민지화 등의 벽을 따라 마이그레이션하는 것이 사실은 2 공부하기가 대단히 어렵다. 분야의 발전에도 불구하고, PGC 형성과 분화를 이해하려는 연구들은 제한된 수의 위치 및 철새 성격 3,4에 의해 방해되었다.
최근 배아 줄기 세포는 체외 5,6에서 생식 세포를 형성 할 수있는 잠재력을 가지고 보여왔다. 마찬가지로, 여러 체세포 줄기 세포는 배아 세포가 FOLL 형성 할 수있는 잠재력을 가지고 표시되었습니다체외 배양 7-11 때문에. 최근 신생아 쥐의 피부에서 분리 된 줄기 세포 배아 같은 세포와 초기 단계의 난자를 12으로 체외에서 분화되었다. 분화 OCT4을 표현하는 줄기 세포의 집합이 증가하고 구조를 닮은 적운-난자 복합체가 형성되었다. 난 모세....
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프로토콜
1. 미디어 준비
- 실험이 진행되는 세포 배양 인큐베이터에서 느슨해 캡 사용 및 장소를 사전에 용지 2 ~ 3 시간을 준비합니다. 본 프로토콜에서 사용 미디어 :
- 1 개 B27, 40 NG / ML bFGF를, 20 NG / ML EGF와 보충 DMEM/F12로 구성된 세포 매체를 줄기 준비한다.
- 0.05 IU의 FSH, 0.03 IU LH, 3 MG / ML BSA, 5 μL / ㎖ ITS, 0.23 mM의 나트륨 피루 베이트, 1 MG / ML Fetuin, 1 NG / ML EGF와 보충 M199로 구성된 생식 세포 분화 매체를 준비합니다. 모든 첨가제로 구성하지만, FSH를 생략 기본 매체는, LH 및 EGF는 ° C까지 1 주일을 준비하고 4시에 저장할 수 있습니다.
2. 세포 배양 준비 줄기
- 이전 12 설명 된대로 신생아 쥐 새끼에서 줄기 세포를 분리. 체외 배아 세포 분화에 대한 구절 2-4에서 줄기 세포를 사용합니다. 의 효율성OLC 형성은 바로 시작 줄기 세포의 품질에 관련되어 있습니다. 그것은 곧 인구가 통과 약 2에서 일반적으로하는 깨끗하고 건강한 나타나는 분화를 시작하....
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결과
처음에는 세포가 배양 접시 바닥에 부착 확산. 차별화에 42-72 시간에 작은 정지 OCT4 양성 세포가 형성하고 (그림 1A) 확산. 곧 이러한 세포의 시각화 후 대부분 사라지고 첨부 된 세포 배양 하단에 밀도 식민지 집계를 형성합니다. 몇 일 다음이 집계 문화 표면에서 분리합니다. 이러한 골재의 일부 대형 세포 (그림 1B 및 1C) 관찰 할 수있다. 초기 구상에 따라 세포는 직경 ~ 35 μm의 수 있습니다. 지속적인 문화 OLCs 직경 ~ 45 μm의에 도달하기 위해 성장할 것이다. 이들은 OLCs하고 지원 세포 수집하거나 (그림 1D) 부착 다른 세포없이 OLCs을 얻기 위해 트립신 할 수 있습니다.
OLCs 자연 난자와 유사한 성적을 표현할 수 있는지 확인하기 위해 OLCs를 수집하고 테스트 할 수 있습니다ZPC, Scp3, CMOS OC.......
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토론
기능 OLCs 날짜를하려면 생체 분석에 완벽을 사용하여 개발되지 않았습니다. 최근 하야시 외 의해 연구. 체외에서 형성되고 발전 14 생체 내에서 전송되는 세포 PGC 같은에서 자손을 생산할 수 있었다. 그들은 생체 이식 후 회복, 세포처럼 PGC를 형성 할 수 있었다 ES 세포 나 유도 만능 세포로 시작은 성숙 시비, 자손 14를 생성하는 데 사용 될 수 있었다. 이 다양한 소스로부터의 줄기 세포가 기능 난자를 형성하기 위해, 올바른 조건 하에서 잠재력을 가지고 보여줍니다.
문화 시스템의 특정 측면은 기능에 중요하다. 줄기 세포를 분리하기 위하여 이용 생쥐의 변형은 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 잭슨 연구소 (주식 # 008214)에서 B6 생쥐로 개발하여 사용 하였다. 이 마우스는 허용 OCT4-EGFP 유전자를 가지고 힘을EGFP 단백질을 통해 OCT.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
PWD 웨스턴 대학의 제럴드 M. 키더에 건강 연구 교제 (CIHR)와 CIHR 부여의 캐나다 연구소에 의해 지원됩니다. 저자는 여기에 제시 프로토콜의 개발에 도움을 구 엘프 대학에서 Julang 리를 인정하고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| 피루브산 나트륨 | 11360-070 | ||
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 웰 플레이트 | Nunc | 144530 | |
| 10cm 접시 | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml 튜브 | BD | 352095 |
참고문헌
- van den Hurk, R., Zhao, J. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).
- Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. Time-lapse analysis of living ....
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재인쇄 및 허가
