Lasermicrodissectie van neuronen van Gedifferentieerd Human Neuroprogenitor Cellen in Cultuur
Summary
Menselijke neuroprogenitor cellen (NPC) werden uitgebreid onder uitdijende omstandigheden. NPCs werden gedifferentieerd in neuron-rijke culturen in aanwezigheid van een combinatie van neurotrofinen. Neuronale merkers werden gedetecteerd door immunofluorescentie kleuring. Om een zuivere populatie van neuronen te isoleren, werden NPCs gedifferentieerd PEN membraan glijbanen en lasermicrodissectie werd uitgevoerd.
Abstract
Neuroprogenitor cellen (NPC) geïsoleerd uit de humane foetale hersenen werden onder proliferatieve aandoeningen uitgebreid in de aanwezigheid van epidermale groeifactor (EGF) en fibroblast groeifactor (FGF) een overvloedige toevoer van cellen. NPCs werden gedifferentieerd in de aanwezigheid van een nieuwe combinatie van zenuwgroeifactor (NGF), van hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) en retinoïnezuur op de vaat bekleed met poly-L-lysine en muis laminine te verkrijgen neuron -rijke culturen. NPCs werden gedifferentieerd in afwezigheid van neurotrofinen, DBC en retinoïnezuur en in aanwezigheid van ciliaire neurotrofe factor (CNTF) naar astrocyt-rijke culturen verkregen. Gedifferentieerde NPCs werden gekenmerkt door immunofluorescentiekleuring voor een panel van neuronale markers inclusief NeuN, synapsine, acetylcholinesterase, synaptofysine en GAP43. Gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) en STAT3, astrocyten markers, werden gedetecteerd in 10-15% van de gedifferentieerde NPCs. Ter vergemakkelijkingceltype specifieke moleculaire karakterisering, werd lasermicrodissectie uitgevoerd om neuronen gekweekt op polyethyleennaftalaat (PEN) membraan dia's te isoleren. De in deze studie beschreven methoden leveren waardevolle instrumenten om ons begrip van de moleculaire mechanismen van neurodegeneratie te bevorderen.
Introduction
Permanente neurogenese is gekend om in subventriculaire zone van de laterale ventrikels en de subgranulaire laag van de dentate gyrus van de volwassen zoogdierhersenen 1. Neuroprogenitor cellen (NPC's) die afkomstig zijn uit deze regio's zijn multipotente cellen die kunnen differentiëren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten 2. NPCs hebben gegenereerd belang omdat zij kunnen worden getransplanteerd in patiënten met diverse neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, amyotrofische laterale sclerose, beroerte en ziekte (AD) 3 Alzheimer. Onderzoeken met NPC het algemeen gericht op deze transplantatie hoek maar de mogelijkheden van NPC-afgeleide neuronen als celcultuurmodel het mechanisme van neurodegeneratie bepalen niet volledig benut. Eerdere studies hebben algemeen gebruikt na mitotische neuronen geïsoleerd uit inproefdierhersenen weefsels die moeten worden geïsoleerd voor elk experiment zij nietzelfvernieuwende. Hoewel humane neuroblastoma cellijnen zoals SH-SY5Y en SK-N-MC cellen kunnen worden geëxpandeerd, hebben zij niet de kenmerken van primaire neuronen. Menselijke NPCs, anderzijds, hebben zowel voordelen omdat ze kunnen worden uitgebreid voor meerdere doorgangen en kunnen worden gedifferentieerd om een celpopulatie genereren met de kenmerken van primaire neuronen 4,5. In de huidige studie, een nieuwe differentiatie protocol beschrijven we een consistente neuron-rijke bevolking te verkrijgen uit commercieel beschikbare NPC's geïsoleerd uit menselijke foetale hersenen. Omdat deze kweken bevatten een klein percentage van gliacellen, zijn ook andere methoden om een zuivere populatie van neuronen voor moleculaire karakterisering te isoleren. Laser capture microdissectie (LCM) is een nieuwe techniek waarbij een homogene populatie van cellen van een weefselsectie selectief kan worden vastgelegd voor genexpressieanalyse 6. Het brein is een heterogeen weefsel dat bestaat uit neuronen, glia en andere mobiele types. LCM is gebruikt om neuron-specifieke genexpressie te bepalen analyses 7-10. We hebben eerder uitgevoerd LCM van hippocampale neuronen uit AD (Tg2576) muis hersenen secties om verminderde expressie van cyclisch AMP respons element binding protein (CREB) en BDNF blijkt specifiek in de hippocampus neuronen 11. In deze studie beschrijven we procedures voor de uitbreiding van menselijke NPCs, neuronale differentiatie, immunofluorescentie kleuring voor neuronale merkers en LCM voor het isoleren van neuronen gekweekt op objectglaasjes PEN membraan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij beschrijven in deze studie een neuron-rijke celcultuurmodel door differentiatie van zelf-vernieuwing neuroprogenitor menselijke cellen en een methode om een zuivere populatie van neuronen isoleren laser capture microdissectie. We hebben een combinatie van NGF, BDNF, DBC en retinoïnezuur voor neuronale differentiatie van NPCs gebruikt. DBC wordt gebruikt om CREB een transcriptiefactor die neurogenese 12 verbetert activeren. Retinoïnezuur induceert celcyclus verlaten en vermindert de gliale bevolkin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Merit Beoordeling subsidie (NEUD-004-07F) van de Veterans Administration (SP).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
References
- Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
- Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
- Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
- Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
- Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
- Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
- Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
- Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer’s brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60 (2011).
- Dworkin, S., Mantamadiotis, T. Targeting CREB signalling in neurogenesis. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).
- Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
- Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
- Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).
