Numérique Inline Holographic Microscopy (SMIH) de faiblement diffusant Sujets

Summary

Les emplacements en trois dimensions des objets faiblement diffusion peuvent être identifiés de manière unique à l'aide en ligne numérique microscopie holographique (SMIH), ce qui implique une modification mineure à un microscope standard. Notre logiciel utilise une heuristique d'imagerie simple, couplé avec Rayleigh-Sommerfeld rétro-propagation pour obtenir la position en trois dimensions et la géométrie d'un objet de phase microscopique.

Abstract

Objets faiblement diffusantes, telles que de petites particules colloïdales et la plupart des cellules biologiques, se rencontrent fréquemment dans la microscopie. En effet, une série de techniques ont été développées afin de mieux visualiser ces objets de phase; contraste de phase et DIC sont parmi les méthodes les plus populaires pour améliorer le contraste. Toutefois, l'enregistrement position et la forme dans la direction hors-imagerie-plan reste difficile. Ce rapport présente une méthode expérimentale simple pour déterminer avec précision l'emplacement et la géométrie des objets en trois dimensions, en utilisant la microscopie holographique numérique en ligne (SMIH). D'une manière générale, le volume de l'échantillon accessible est définie par la taille du capteur de la caméra dans la direction latérale, et la cohérence de l'éclairage dans la direction axiale. Volumes d'échantillons typiques vont de 200 um x 200 um x 200 um en utilisant un éclairage à LED, pour5 mm x 5 mm x 5 mm ou plus en utilisant un éclairage laser. Cette lumière d'éclairage est configuré de telle sorte que les ondes planes sont incidents sur l'échantillon. Les objets dans le volume de l'échantillon puis diffusent la lumière, ce qui interfère avec la lumière non diffusée pour former des motifs d'interférence perpendiculaire à la direction d'illumination. Cette image (l'hologramme) contient les informations de profondeur requise pour la reconstruction en trois dimensions, et peut être capturé sur un dispositif de formation d'image standard comme une caméra CMOS ou CCD. La méthode de retour propagation de Rayleigh-Sommerfeld est utilisé pour recentrer numériquement des images de microscope, et une heuristique simple imagerie basée sur la phase de Gouy anomalie est utilisé pour identifier la diffusion des objets dans le volume reconstruit. Cette méthode simple mais robuste en résulte une mesure sans équivoque, sans modèle de l'emplacement et la forme des objets dans des échantillons microscopiques.

Introduction

Inline microscopie holographique numérique (SMIH) permet l'imagerie rapide tridimensionnel d'échantillons microscopiques, telles que les micro-organismes de natation ^1,2 et systèmes de la matière molle ^{de 3,4,} avec un minimum de modifications à une configuration de microscope standard. Dans cet article, une démonstration pédagogique de SMIH est fourni, centrée autour des logiciels développés dans notre laboratoire. Ce document comprend une description de la façon de mettre en place le microscope, d'optimiser l'acquisition de données, et de traiter les images enregistrées pour reconstruire les données en trois dimensions. Le logiciel (basé en partie sur des logiciels développés par la DG Grier et autres ⁵⁾ et des exemples d'images sont disponibles gratuitement sur ​​notre site. Une description est disponible sur les étapes nécessaires pour configurer le microscope, reconstruire les volumes en trois dimensions à partir d'hologrammes et de rendre les volumes résultant d'intérêt en utilisant un rayon libre traçage logiciel. Le document se termine par une discussion des facteurs qui affectent la qualité de la reconstruction, Et une comparaison avec les méthodes de SMIH concurrentes.

Bien SMIH a été décrit il ya quelque temps (pour une revue générale de ses principes et de développement, voir Kim ^6), la puissance de calcul nécessaire et l'image expertise de traitement a jusqu'ici largement restreint son utilisation à des groupes de recherche spécialisés en mettant l'accent sur ​​le développement de l'instrument. Cette situation est en train de changer à la lumière des récents progrès de l'informatique et de la technologie de l'appareil photo. Ordinateurs de bureau modernes peuvent facilement faire face à la transformation et les exigences de stockage de données; CCD ou CMOS caméras sont présentes dans la plupart des laboratoires de microscopie, et le logiciel nécessaire est en cours mis à disposition gratuitement sur Internet par des groupes qui ont investi du temps dans le développement de la technique.

Divers systèmes ont été proposés pour l'imagerie de la configuration des objets microscopiques dans un volume d'échantillon en trois dimensions. Beaucoup d'entre eux sont à balayage techniques ^7,8, dans lequel une pile d'images est enregistré par mtraduire echanically le plan image à travers l'échantillon. confocale à balayage microscopie à fluorescence est peut-être l'exemple le plus connu. Typiquement, un colorant fluorescent est ajouté à un objet de phase afin d'obtenir un niveau acceptable de contraste de l'échantillon, et l'agencement confocal utilisé pour localiser spatialement l'émission fluorescente. Cette méthode a permis des avancées significatives, par exemple dans la science des colloïdes où il a permis l'accès à la dynamique en trois dimensions des systèmes bondés ^9-11. L'utilisation de l'étiquetage est une différence importante entre la microscopie confocale de fluorescence et SMIH, mais d'autres caractéristiques des deux techniques sont la peine de comparer. SMIH a un avantage considérable de la vitesse en ce que le dispositif comporte pas de pièces mobiles. Les miroirs de balayage mécanique dans les systèmes confocaux placer une limite supérieure du taux d'acquisition de données – généralement autour de 30 images / sec pour une image de 512 x 512 pixels. Une pile de ces images provenant de différents plans focaux peut être obtenue par physiquement translAting l'étage d'échantillon ou de lentille d'objectif entre les images, ce qui conduit à un taux de capture finale d'environ un volume par seconde pour une trame pile 30. En comparaison, un système holographique basé sur une caméra CMOS moderne peut capturer 2000 images / s à la même taille et résolution d'image, chaque image est traitée `offline 'pour donner un aperçu indépendant du volume de l'échantillon. Pour réitérer: échantillons fluorescents sont pas nécessaires pour SMIH, même si un système a été mis au point qui effectue la reconstruction holographique d'un objet fluorescent ^12. Ainsi que des informations de volume tridimensionnel, SMIH peut également être utilisé pour fournir quantitatives des images à contraste de phase ^13, mais qui est au-delà de la portée de la discussion ici.

Images de données brutes SMIH sont en deux dimensions, et à certains égards, ressemblent à des images de microscope standard, mais pas au point. La principale différence entre SMIH et la microscopie en champ clair norme réside dans les anneaux de diffraction qui entourent les objets in le champ de vision; ceux-ci sont dues à la nature de l'illumination. SMIH nécessite une source plus cohérent que le champ lumineux – généralement une LED ou laser. Les anneaux de diffraction de l'hologramme contiennent les informations nécessaires pour reconstruire une image en trois dimensions. Il existe deux approches principales pour l'interprétation des données; SMIH recentrage montage et numérique directe. La première approche est applicable dans les cas où la forme mathématique de la figure de diffraction est connue à l'avance ^3,4; cette condition est remplie par une petite poignée d'objets simples comme des sphères, des cylindres, et les obstacles demi-plan. Montage direct est également applicable dans les cas où la position axiale de l'objet est connue, et l'image peut être fixé à l'aide d'une table de modèles d'image ¹⁴ consultation.

La deuxième approche (de refocalisation numérique) est un peu plus grand et repose sur l'utilisation d'anneaux de diffraction de l'image holographique à deux dimensions de reconstruire numériquement le champ optique àun certain nombre de (arbitrairement) espacées plans focaux dans tout le volume de l'échantillon. Plusieurs méthodes existent connexes pour ce faire ^6; ce travail utilise le Rayleigh-Sommerfeld dos technique de propagation comme décrit par Lee et Grier ^5. Le résultat de cette procédure est une pile d'images qui reproduisent l'effet de modifier manuellement le plan focal du microscope (d'où le nom de `recentrage numérique»). Une fois qu'une pile d'images a été généré, la position de l'objet dans le volume focal doit être obtenue. Un certain nombre de procédés heuristiques de l'analyse de l'image, telles que la variance de l'intensité locale ou le contenu de fréquence spatiale, ont été présentés afin de quantifier la finesse de focalisation en des points différents dans l'échantillon ^15. Dans chaque cas, quand une image métrique particulière est maximisée (ou réduit), l'objet est considéré comme la mise au point.

Contrairement à d'autres régimes qui cherchent à identifier un plan focal particulier où un objet est «mise au point», la méthode dans ce travail choisit points qui se trouvent à l'intérieur de l'objet d'intérêt, qui peuvent s'étendre sur un large éventail de plans focaux. Cette approche est applicable à un large éventail de sujets et est particulièrement adapté pour étendues, des échantillons faiblement diffusion (objets de phase), tels que des colloïdes en forme de tige, les chaînes de bactéries ou de flagelles eucaryotes. Dans ces échantillons, le contraste de l'image change lorsque l'objet passe à travers le plan focal, une image défocalisée possède un centre de lumière si l'objet est sur un côté du plan focal et un centre sombre si elle est à l'autre. Objets de phases pures ont peu à pas de contraste quand ils se trouvent exactement dans le plan focal. Ce phénomène de contraste inversion a été discutée par d'autres auteurs ^16,17 et est finalement due à la phase de Gouy anomalie ^18. Cela a été mis sur un pied plus rigoureuse dans le cadre de l'holographie ailleurs, là où les limites de la technique sont évalués; l'incertitude typique de position est de l'ordre de 150 nm (environ un pixel) dans each direction ^19. La méthode phase de Gouy anomalie est l'un des rares régimes de SMIH bien définis pour déterminer la structure des objets étendus dans les trois dimensions, mais néanmoins certains objets sont problématiques à reconstruire. Les objets qui se trouvent directement le long de l'axe optique (pointage à la caméra) sont difficiles à reconstituer avec précision, les incertitudes dans la longueur et la position de l'objet deviennent grandes. Cette limitation est due en partie à la profondeur de bits limité de pixels d'enregistrement de l'hologramme (le nombre de niveaux de gris distinctes que l'appareil peut enregistrer). Un autre problème survient lorsque la configuration de l'objet d'intérêt est très proche du plan focal. Dans ce cas, les images réelles et virtuelles de l'objet sont reconstruits à proximité, donnant lieu à des champs optiques complexes qui sont difficiles à interpréter. Une autre préoccupation, un peu moins important ici est que les franges de diffraction résultant occupent moins du capteur d'image, et ce inf gros grainsormation conduit à une reconstruction de moins bonne qualité.

En pratique, un filtre à gradient simple est appliqué à des volumes reconstruits en trois dimensions pour détecter les inversions d'intensité de solides le long de la direction d'illumination. Régions où l'intensité change rapidement de la lumière à l'obscurité, ou vice versa, sont ensuite associées à des régions de diffusion. Objets faiblement diffusion sont bien décrits comme une collection sans interaction de ces éléments ^20; ces contributions individuelles somme à donner le champ diffusé totale qui est facilement inversé avec le dos méthode de propagation de Rayleigh-Sommerfeld. Dans ce document, la technique du gradient d'intensité axiale est appliquée à une chaîne de cellules de Streptococcus. Les corps cellulaires sont des objets de phase (l'espèce E. coli a un indice de réfraction mesuré ²¹ pour être 1,384 à une longueur d'onde λ = 589 nm; la souche de Streptococcus est susceptible d'être similaire) et apparaissent comme une chaîne à haute intensité de gouttes connectés à ee volume d'échantillon en aval du filtre à gradient a été appliqué. Seuil et longs méthodes classiques d'extraction appliqués à ce volume filtré permettent l'extraction des pixels volumétriques (voxels) correspondant à la région à l'intérieur des cellules. Un avantage particulier de ce procédé est qu'il permet la reconstruction sans équivoque de la position d'un objet dans la direction axiale. Des méthodes similaires (au moins, ces hologrammes qui enregistrent près de l'objet, imagées par un objectif de microscope) souffrent d'être incapable de déterminer le signe de ce déplacement. Bien que la méthode de Rayleigh-Sommerfeld reconstruction est également signer indépendant en ce sens, l'opération de gradient permet de discriminer entre les objets de phase faibles ci-dessus et en dessous du plan focal.

Protocol

Une. Configuration et acquisition de données Cultiver une culture de Streptococcus souche V4051-197 (natation lisse) cellules dans un milieu KTY de stock congelé 22. Incuber dans un agitateur rotatif pendant une nuit à 35 ° C et 150 tours par minute, à la saturation. Inoculer 10 ml de milieu KTY frais avec 500 pi de la culture saturée. Incuber pendant encore 3,5 h à 35 ° C et 150 tours par minute jusqu'à ce que les cellules atteignent une densité optique d'envir…

Representative Results

Pour démontrer les capacités de SMIH, des expériences ont été réalisées sur une chaîne de bactéries Streptococcus. La chaîne se mesure 10,5 mm de long, et était composé de 6-7 cellules sphéro-cylindrique (deux des cellules de la chaîne sont proches de la division) avec des diamètres dans la gamme 0,6-1 um. Figures 1a et 1b montrent l'interface principale de la reconstruction et des logiciels de rendu. Des exemples de la procédure de recentrage numérique son…

Discussion

L'étape la plus importante dans ce protocole expérimental est la capture précise des images à partir d'un dispositif expérimental stable. Avec les données de base pauvres, la reconstruction haute fidélité est à peu près impossible. Il est également important d'éviter les lentilles de l'objectif avec un élément de contraste de phase interne (visible comme un anneau sombre en regardant à travers l'arrière de l'objectif), comme cela peut dégrader l'image reconstruite. L'obje…

Materials

Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon Corp.
LED	Thorlabs	M660L3	emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm
LED power supply	Thorlabs	LEDD1B
Thread Adapter	Thorlabs	SM2T2
Thread Adapter	Thorlabs	SM1A2
Frame Grabber board	EPIX	PIXCI E4
High-Speed CMOS camera	Mikrotron	MC-1362