דיגיטלי Inline הולוגרפי מיקרוסקופית (DIHM) של נושאים בחולשת פיזור
Summary
המקומות תלת ממדיים של אובייקטים בחולשה-פיזור יכולים להיות מזוהים באופן ייחודי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי מוטבע הולוגרפית (DIHM), הכולל שינוי קל במיקרוסקופ רגיל. התוכנה שלנו משתמשת היוריסטי הדמיה פשוטה יחד עם ריילי-זומרפלד גב ההתפשטות להניב את המיקום ואת הגיאומטריה של אובייקט שלב מיקרוסקופי תלת ממדים.
Abstract
אובייקטים בחולשה-פיזור, כגון חלקיקי colloidal קטנים ורוב תאים ביולוגיים, הם נתקלו לעתים קרובות במיקרוסקופ. אכן, מגוון רחב של טכניקות פותחו כדי להמחיש טוב יותר אובייקטי השלב הבאים; ניגוד השלב ודסק"ש הם בין השיטות הפופולריות ביותר לשיפור קונטרסט. עם זאת, עמדת הקלטה וצורה בכיוון מחוץ להדמית מטוס נותרים מאתגרות. דו"ח זה מציג את שיטה ניסיונית פשוטה כדי לקבוע במדויק את המיקום וגיאומטריה של אובייקטים בשלושה ממדים, באמצעות מיקרוסקופ הולוגרפי מוטבע דיגיטלי (DIHM). באופן כללי, הנגיש נפח הדגימה מוגדר על ידי גודל חיישן המצלמה בכיוון לרוחב, ולכידות התאורה בכיוון הצירי. כרכי מדגם אופייניים נעים בין 200 מיקרומטר x 200 מיקרומטר x 200 מיקרומטר באמצעות תאורת LED, ל5 מ"מ x 5 מ"מ x 5 מ"מ ויותר, באמצעות תאורת לייזר. אור ההארה זו מוגדר כך שגלי מטוס הם אירוע על המדגם. אובייקטים בנפח הדגימה אז מפזרים אור, אשר מפריע לאור unscattered כדי ליצור דפוסי התערבות בניצב לכיוון התאורה. תמונה זו (הולוגרמה) מכילה את מידע העומק הנדרש לשחזור תלת ממדי, ויכולה להיות שנתפס על מכשיר הדמיה סטנדרטי כגון ה-CMOS או מצלמת CCD. שיטת גב התפשטות ריילי-זומרפלד מועסקת למקד מחדש מבחינה מספרית תמונות מיקרוסקופ, והיוריסטי הדמיה פשוטה המבוסס על שלב Gouy האנומליה משמשת לזיהוי פיזור אובייקטים בתוך הנפח המשוחזר. שיטה פשוטה אך חזקה כתוצאה ממדידה חד משמעית, ללא מודל של המיקום וצורה של אובייקטים בדגימות מיקרוסקופיות.
Introduction
מיקרוסקופ הולוגרפי מוטבע דיגיטלי (DIHM) מאפשר הדמיה תלת ממדית מהירה של דגימות מיקרוסקופיות, כגון מיקרואורגניזמים שחייה 1,2 ומערכות חומר רכים 3,4, עם שינויים מינימאליים להתקנת מיקרוסקופ רגילה. במאמר זה הפגנה פדגוגית של DIHM מסופקת, סביב תוכנה שפותחה במעבדה שלנו. נייר זה כולל תיאור של איך להגדיר את המיקרוסקופ, לייעל את האיסוף וניתוח נתונים, ולעבד את התמונות שתועדו לשחזר נתונים תלת ממדיים. התוכנה (המבוססת בחלקו על תוכנה שפותח על ידי DG גריר ואחרים 5) ותמונות דוגמא זמינה באופן חופשי באתר האינטרנט שלנו. תיאור מסופק על הצעדים הדרושים כדי להגדיר את המיקרוסקופ, לשחזר נפחים תלת ממדים מהולוגרמות ולעבד כמויות של עניין וכתוצאה מכך באמצעות קרן חופשית התחקות חבילת תוכנה. העיתון מסכם בדיון על גורמים המשפיעים על איכות השיקום, והשוואה של DIHM עם שיטות מתחרות.
למרות DIHM תואר לפני כמה זמן (לסקירה כללית של העקרונות והפיתוח שלה, לראות את קים 6), כוח המחשוב הנדרש ומומחיות עיבוד תמונה עד כה במידה רבה להגביל את השימוש בה לקבוצות מחקר מומחה עם דגש על פיתוח מכשיר. מצב זה משתנה לאור ההתקדמות שחלה באחרונה בטכנולוגית המצלמה מחשוב ו. מחשבים אישיים מודרניים יכולים בקלות להתמודד עם העיבוד ודרישות אחסון נתונים; מצלמות CCD או CMOS נמצאות ברוב המעבדות מיקרוסקופית, והתוכנה הנדרשת הוא עשויה להיות זמינה באופן חופשי באינטרנט על ידי קבוצות שהשקיעו זמן בפיתוח הטכניקה.
תוכניות שונות הוצעו להדמית התצורה של עצמים מיקרוסקופיים בשלושה ממדי נפח דגימה. רבים מאלה סורקים טכניקות 7,8, שבו ערימה של תמונות שתועדה על ידי מ 'echanically תרגום מטוס התמונה באמצעות המדגם. מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal הסריקה הוא אולי הדוגמא המוכרת ביותר. בדרך כלל, צבע פלואורסצנטי מתווסף לאובייקט שלב על מנת להשיג רמה סבירה של ניגוד מדגם, והסדר confocal משמש למקם פליטת ניאון מרחבית. שיטה זו הובילה להתקדמות משמעותית, למשל במדע קולואיד שבו אפשרה גישה לדינמיקה תלת ממדית של מערכות צפופות 9-11. השימוש בתיוג הוא הבדל חשוב בין מיקרוסקופיה confocal פלואורסצנטי וDIHM, אבל תכונות אחרות של שתי הטכניקות הן כדאי להשוות. יש DIHM יתרון מהירות משמעותי בכך שיש לו את המכשיר ללא חלקים נעים. מראות הסריקה מכאניות במערכות confocal להציב גבול עליון לשיעור רכישת נתונים – בדרך כלל סביב 30 מסגרות / שניות לתמונת פיקסל 512 x 512. ניתן לקבל ערימה של תמונות כאלה ממטוסי מוקד שונים על ידי פיזי Translating שלב המדגם או עדשה אובייקטיבית בין מסגרות, מה שמוביל לשיעור לכידה סופי של כ כרך אחד לשנייה עבור מחסנית מסגרת 30. לשם השוואה, מערכת הולוגרפית המבוססת על מצלמת CMOS מודרנית יכולה ללכוד 2,000 מסגרות / שנייה באותו גודל התמונה ורזולוציה; כל תמונת מעובדת `מחובר 'לתת תמונת מצב בלתי תלויה בנפח הדגימה. כדי לחזור ולהדגיש: דגימות ניאון אינן נדרשות לDIHM, אם כי מערכת פותחה שמבצעת שחזור הולוגרפי של נושא ניאון 12. כמו גם מידע נפח תלת ממדים, DIHM יכול לשמש גם כדי לספק תמונות לעומת שלב הכמותי 13, אבל זה מעבר להיקף של הדיון כאן.
תמונות הנתונים הגולמיים DIHM הן דו ממדיות, ובמובנים מסוימים נראות כמו תמונות מיקרוסקופ רגילות, אם כי מחוץ לפוקוס. ההבדל העיקרי בין DIHM ומיקרוסקופ שדה בהיר סטנדרטי טמון בטבעות העקיפה המקיפות את אובייקטי in את שדה הראיה, אלו הן בשל האופי של התאורה. DIHM דורש מקור קוהרנטית יותר מ שדה בהיר – בדרך כלל LED או לייזר. הטבעות העקיפה בהולוגרמה מכילות את המידע הדרוש כדי לשחזר תמונה תלת ממדית. ישנן שתי גישות עיקריות לפרשנות נתוני DIHM; מיקוד מחודש ראוי ומספרי ישיר. הגישה הראשונה היא ישימה במקרים בהם הצורה המתמטית של התבנית העקיפה ידועה מראש 3,4; תנאי זה מתקיים על ידי קומץ קטן של אובייקטים פשוטים כמו כדורים, גלילים, ומכשולים חצי מטוס. התאמה ישירה היא גם ישימה במקרים בהם המצב הצירי של האובייקט ידוע, והתמונה יכולה להיות מצוידת באמצעות טבלה להסתכל למעלה של תבניות תמונה 14.
הגישה השנייה (מיקוד המחודש מספרי) היא די כללית יותר ומסתמכת על שימוש בטבעות העקיפה בדמות הולוגרמה דו ממדים לשחזר את השדה האופטי מבחינה מספרית במספר המטוסים (במרווחים באופן שרירותי) המוקדים ברחבי נפח הדגימה. מספר שיטות הקשורים קיימות עבור עושה 6 זה; עבודה זו משתמשת ריילי-זומרפלד חזרה טכניקת התפשטות כפי שתאר לי וגריר 5. התוצאה של הליך זה היא ערימה של תמונות המחקות את ההשפעה של שינוי מטוס מיקרוסקופ המוקד (ומכאן השם `מיקוד המחודש מספרי") באופן ידני. ברגע שערימה של תמונות כבר נוצרה, יש לקבל את עמדתו של הנושא בהיקף המוקד. מספר היוריסטיות ניתוח תמונה, כמו שונות עוצמת מקומית או תוכן תדר המרחבי, הוצג לכמת את חדות מיקוד בנקודות שונות במדגם 15. בכל מקרה, כאשר מדד תמונה מסוים מוגדל (או למזער), האובייקט נחשב בפוקוס.
בניגוד לתוכניות אחרות שמבקשות לזהות מטוס מוקד מסוים שבו אובייקט הוא "בפוקוס", השיטה בעבודה זו מרימה את points ששוכב בתוך האובייקט של עניין, אשר עשוי להאריך על פני מגוון רחב של מטוסי מוקד. גישה זו חלה על מגוון רחב של נושאים, והוא מתאים במיוחד להארכה, דגימות בחולשה-פיזור (אובייקטי שלב), כגון קולואידים בצורת מוט, שרשרות של חיידקים או שוטונים אוקריוטים. בדגימות כגון ניגוד התמונה משתנה כאשר האובייקט עובר דרך מישור המוקד; יש תמונה לא ממוקדת מרכז אור אם האובייקט הוא בצד אחד של מטוס המוקד ומרכז כהה, אם זה בצד השני. יש לא מעט ניגוד אובייקטי שלב טהורים כאשר הם שוכבים בדיוק במישור המוקד. תופעה זו של היפוך לעומת זאת נדונה על ידי מחברים אחרים 16,17 וסופו של דבר בשל שלב Gouy האנומליה 18. זה כבר הכניס על בסיס קפדני יותר בהקשר של הולוגרפיה במקום אחר, שבו הגבולות של הטכניקה מוערכים; חוסר הוודאות האופיינית בעמדה היא בסדר גודל של 150 ננומטר (כפיקסל) בEACכיוון שעות 19. שיטת האנומליה שלב Gouy היא אחת תוכניות DIHM המוגדרות היטב כמה לקביעת המבנה של אובייקטים מורחבים בשלושה ממדים, אבל בכל זאת כמה אובייקטים הם בעייתיים לשחזר. אובייקטים הנמצאים באופן ישיר לאורך הציר האופטי (מצביע על המצלמה) הם קשה לשחזר במדויק; אי ודאויות באורך והמיקום של האובייקט להיות גדולות. מגבלה זו היא בין שאר בשל העומק הסיביות המוגבל של פיקסלים הקלטת הולוגרמה (מספר הרמות האפורות שונות שהמצלמה יכולה להקליט). עוד תצורה בעייתית מתרחשת כאשר מושא העניין הוא קרוב מאוד למישור המוקד. במקרה זה, תמונות אמיתיות ווירטואליות של האובייקט משוחזרים בסמיכות, והוליד שדות אופטיים מסובכים שקשה לפרש. חשש שני, מעט פחות חשוב כאן הוא ששולי עקיפה וכתוצאה מתופסים פחות של חיישן התמונה, וinf גרנולות גס זהormation מוביל לשיקום עני באיכות.
בפועל, מסנן שיפוע פשוט מוחל כרכים משוחזרים תלת ממדים כדי לזהות היפוכי עוצמה חזקים לאורך כיוון התאורה. אזורים שבם בעוצמה משתנה במהירות מהאור לחושך, או להיפך, אז הם קשורים באזורי פיזור. אובייקטים בחולשה-פיזור מתוארים גם כאוסף noninteracting של אלמנטים כגון 20; סכום תרומות הבודד האלה לתת את השדה המפוזר בסך הכל שהוא הפוך בקלות באמצעות גב שיטת ריבוי ריילי-זומרפלד. במאמר זה, טכניקת שיפוע עוצמת צירית מוחלת על שרשרת של תאי סטרפטוקוקוס. גופי התא הם אובייקטי שלב (יש החיידק מיני מקדם שבירה נמדדה 21 להיות 1.384 בλ = 589 ננומטר אורך גל; מתח סטרפטוקוקוס צפוי להיות דומה) ותופיע כשרשרת בעוצמה גבוהה של כתמים מחוברים ב הלאחר סינון שיפוע דואר נפח דגימה יושם. שיטות מיצוי סטנדרטיות סף והתכונה להחיל נפח מסונן זה מאפשרים המיצוי של פיקסלים נפח (voxels) המתאימים לאזור בתוך התאים. יתרון מסוים של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת שחזור חד משמעי של העמדה של אובייקט בכיוון הצירי. שיטות דומות (לפחות, שהולוגרמות אלה השיא קרובים לאובייקט, צילמו באמצעות מיקרוסקופ מטרה) סובלות מחוסר יכולת לקבוע את הסימן של עקירה זו. למרות ששיטת שחזור ריילי-זומרפלד גם לחתום עצמאי במובן זה, הפעולה הדרגתית מאפשרת לנו להבחין בין עצמים שלב החלשים מעל ומתחת למישור המוקד.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצעד החשוב ביותר בפרוטוקול ניסוי זה הוא הלכידה מדויקת של תמונות מהתקנה ניסיונית יציבה. עם נתוני רקע עניים, שיקום באיכות גבוהה הוא כמעט בלתי אפשרי. כמו כן, חשוב להימנע מעדשות אובייקטיביות עם אלמנט פנימי שלב ניגוד (נראה כמו annulus כהה כאשר מסתכל דרך החלק האחורי של אובייקט?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים ללינדה טרנר לקבלת סיוע בהכנת המיקרוביולוגית. RZ וLGW מומנו על ידי מכון רולנד בהרווארד וCGB מומן כחוקר של קרן שכמיות, המדע ללא גבולות תכנית, ברזיל (# 7340-11-7 תהליך)
Materials
| Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon Corp. | ||
| LED | Thorlabs | M660L3 | emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm |
| LED power supply | Thorlabs | LEDD1B | |
| Thread Adapter | Thorlabs | SM2T2 | |
| Thread Adapter | Thorlabs | SM1A2 | |
| Frame Grabber board | EPIX | PIXCI E4 | |
| High-Speed CMOS camera | Mikrotron | MC-1362 |
References
- Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. Digital in-line holography for biological applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).
- Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R. Digital holographic microscopy reveals prey-induced changes in swimming behavior of predatory dinoflagellates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17512-17517 (2007).
- Lee, S. H., Roichman, Y., et al. Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy. Opt. Express. 15 (26), 18275-18282 (2007).
- Fung, J., Martin, K. E., Perry, R. W., Katz, D. M., McGorty, R., Manoharan, V. N. Measuring translational, rotational, and vibrational dynamics in colloids with digital holographic microscopy. Opt. Express. 19 (9), 8051-8065 (2011).
- Lee, S. H., Grier, D. G. Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures. Opt. Express. 15 (4), 1505-1512 (2007).
- Kim, M. Principles and techniques of digital holographic microscopy. SPIE Rev. 1, 018005 (2010).
- Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. Tracking sperm in three-dimensions. Biochem. Biophys. Res. Comm. 373, 125-129 (2008).
- Santi, P. Light Sheet Fluorescence Microscopy : A Review. J. Histochem. Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- van Blaaderen, A., Wiltzius, P. . Real-Space Structure of Colloidal Hard-Sphere Glasses. Science. 270, 1177-1179 (1990).
- Besseling, R., Weeks, E. R., Schofield, A. B., Poon, W. C. K. Three-Dimensional Imaging of Colloidal Glasses under Steady Shear. Phys. Rev. Lett. 99, 028301 (2007).
- Schall, P., Weitz, D., Spaepen, F. Structural Rearrangements That Govern Flow in Colloidal Glasses. Science. 318, 1895-1899 (2007).
- Rosen, J., Brooker, G. Fluorescence incoherent color holography. Opt. Exp. 15, 2244-2250 (2007).
- Jericho, M. H., Kreuzer, H. J., Kanka, M., Riesenberg, R. Quantitative phase and refractive index measurements with point-source digital in-line holographic microscopy. Appl. Opt. 51 (10), 1503-1515 (2012).
- Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T., Ozcan, D. T. A. Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical. J. Vis. Exp. 34, (2009).
- Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl. Opt. 47 (19), (2008).
- Elliot, M. S., Poon, W. C. K. Conventional optical microscopy of colloidal suspensions. Adv. Coll. Interf. Sci. 92, 133-194 (2001).
- Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Phys. Rev. E. 67, 051904 (2003).
- Born, M., Wolf, E. . Principles of Optics, 6th Ed. , (1998).
- Wilson, L., Zhang, R. 3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation. Opt. Express. 20, 16735-16744 (2012).
- Bohren, C., Huffman, D. . Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).
- Balaev, A. E., Dvoretski, K. N., Doubrovski, V. A. Refractive index of escherichia coli cells. Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III. 4707 (1), 253-260 (2002).
- Berg, H. C., Manson, M. D., Conley, M. P. Dynamics and Energetics of Flagellar Rotation in Bacteria. Symp. Soc. Exp. Biol. 35, 1-31 (1982).
- Garcia-Sucerquia, J., Xu, W., Jericho, S. K., Klages, P., Jericho, M. H., Kreuzer, H. J. Digital in-line holographic microscopy. Appl. Optics. 45 (5), 836-850 (2006).
- Restrepo, J. F., Garcia-Sucerquia, J. Magnified reconstruction of digitally recorded holograms by Fresnel-Bluestein transform. Appl. Optics. 49 (33), 6430-6435 (2010).
- Dubois, F., Joannes, L., Legros, J. C. Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence. Appl. Optics. 38 (34), 7085-7094 (1999).
- Kanka, M., Riesenberg, R., Petruck, P., Graulig, C. High resolution (NA=0.8) in lensless in-line holographic microscopy with glass sample carriers. Opt. Lett. 36 (18), 3651-3653 (2011).
- Dubois, F., Requena, M. L., Minetti, C., Monnom, O., Istasse, E. Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source. Appl. Optics. 43 (5), 1131-1139 (2004).
- Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Kawagishi, I., Imae, Y., Kudo, S. Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed. Biophysical Journal. 69 (5), 2154-2162 (1995).
- Berg, H. C., Brown, D. A. Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking. Nature. 239 (5374), 500-504 (1972).
- Brooker, G., Siegel, N., Wang, V., Rosen, J. Optimal resolution in Fresnel incoherent correlation holographic fluorescence microscopy. Opt. Express. 19 (6), 5047-5062 (2011).
