Digital Inline holográfica Microscopía (MHDL) de sujetos débilmente dispersión de

Summary

Las ubicaciones tridimensionales de objetos débilmente-dispersión puede ser identificada usando microscopía holográfica digital de línea (MHDL), que implica una modificación menor a un microscopio estándar. Nuestro software utiliza una heurística simple de formación de imágenes junto con Rayleigh-Sommerfeld de propagación hacia atrás para producir la posición en tres dimensiones y la geometría de un objeto de fase microscópica.

Abstract

Objetos débilmente-dispersión, tales como pequeñas partículas coloidales y la mayoría de las células biológicas, se encuentran con frecuencia en la microscopía. De hecho, una amplia gama de técnicas se han desarrollado para visualizar mejor estos objetos de fase; de ​​contraste de fases y DIC se encuentran entre los métodos más populares para mejorar el contraste. Sin embargo, la grabación de posición y la forma en la dirección fuera de la proyección de imagen del plano sigue siendo un reto. Este informe presenta un método experimental sencillo para determinar con precisión la ubicación y la geometría de los objetos en tres dimensiones, utilizando microscopía holográfica digital de línea (MHDL). En términos generales, el volumen de muestra accesible se define por el tamaño del sensor de la cámara en la dirección lateral, y la coherencia de iluminación en la dirección axial. Volúmenes de las muestras típicas oscilan entre 200 micras x 200 m x 200 m utilizando iluminación LED, para5 mm x 5 mm x 5 mm o más grande, utilizando iluminación láser. Esta luz de iluminación está configurado de manera que las ondas planas son incidente sobre la muestra. Los objetos en el volumen de la muestra y luego dispersan la luz, lo cual interfiere con la luz dispersada para formar patrones de interferencia perpendicular a la dirección de la iluminación. Esta imagen (el holograma) contiene la información de profundidad requerida para la reconstrucción en tres dimensiones, y puede ser capturado en un dispositivo estándar de formación de imágenes tal como un CMOS o una cámara CCD. El método de propagación hacia atrás de Rayleigh-Sommerfeld se emplea para reorientar numéricamente imágenes de microscopio, y un simple heurística de imagen basado en la fase de Gouy anomalía se utiliza para identificar la dispersión de objetos dentro del volumen reconstruido. Este método simple pero robusta resulta en una medición inequívoca, modelo libre de la ubicación y la forma de los objetos en muestras microscópicas.

Introduction

Línea digital microscopía holográfica (MHDL) permite rápida obtención de imágenes tridimensionales de muestras microscópicas, tales como microorganismos natación ^1,2 y sistemas de materia blanda ^{de 3,4,} con una mínima modificación a una configuración de microscopio estándar. En este trabajo se ofrece una demostración pedagógica de MHDL, en torno a un software desarrollado en nuestro laboratorio. Este documento incluye una descripción de cómo configurar el microscopio, optimizar la adquisición de datos y procesar las imágenes grabadas para reconstruir los datos en tres dimensiones. El software (basado en parte en software desarrollado por la DG Grier y otros ⁵⁾ y imágenes de ejemplo están disponibles gratuitamente en nuestro sitio web. Se describen los pasos necesarios para configurar el microscopio, reconstruir volúmenes tridimensionales a partir de hologramas y rendir los volúmenes resultantes de interés utilizando un rayo libre de rastreo de paquete de software. El artículo concluye con una discusión de los factores que afectan la calidad de la reconstrucción, Y una comparación de MHDL con métodos que compiten.

Aunque MHDL se describió hace algún tiempo (para una revisión general de sus principios y el desarrollo, ver Kim ^6), la potencia de cálculo necesaria y la experiencia de procesamiento de imágenes que hasta ahora se ha limitado en gran medida su uso a grupos de investigación especializados, con un enfoque en el desarrollo de instrumentos. Esta situación está cambiando a la luz de los últimos avances en informática y tecnología de la cámara. Computadoras de escritorio modernas pueden hacer frente fácilmente con los requisitos de almacenamiento de datos y procesamiento; cámaras CCD o CMOS están presentes en la mayoría de los laboratorios de microscopía, y el software necesario se está a libre disposición en Internet por parte de grupos que han invertido tiempo en el desarrollo de la técnica.

Se han propuesto varios esquemas para obtener imágenes de la configuración de los objetos microscópicos en un volumen de muestra de tres dimensiones. Muchos de estos están escaneando técnicas ^7,8, en el que una pila de imágenes es registrado por mechanically traducir el plano de la imagen a través de la muestra. Microscopía de fluorescencia confocal de barrido es quizás el ejemplo más conocido. Típicamente, se añade un colorante fluorescente a un objeto de fase con el fin de lograr un nivel aceptable de contraste de la muestra, y la disposición confocal utiliza para localizar espacialmente la emisión fluorescente. Este método ha dado lugar a avances significativos, por ejemplo en la ciencia coloidal donde se ha permitido el acceso a la dinámica en tres dimensiones de sistemas de hacinamiento ^09.11. El uso del etiquetado es una diferencia importante entre la microscopía confocal de fluorescencia y MHDL, pero otras características de las dos técnicas son dignos de ser comparados. MHDL tiene una significativa ventaja de velocidad en que el aparato no tiene piezas móviles. Los espejos de barrido mecánico en los sistemas confocales ponen un límite superior en la velocidad de adquisición de datos – por lo general alrededor de 30 cuadros / seg una imagen de píxeles 512 x 512 para. Una pila de tales imágenes de diferentes planos focales se puede conseguir por físicamente translAting la etapa de la muestra o lente de objetivo entre los marcos, que conduce a una tasa de captura final de alrededor de un volumen por segundo para una pila 30 de trama. En comparación, un sistema holográfico sobre la base de una cámara CMOS moderno puede capturar 2000 cuadros / seg en el mismo tamaño y resolución de la imagen; cada trama se procesa `desconectado 'para dar una instantánea independiente del volumen de muestra. Para reiterar: muestras fluorescentes no son necesarios para MHDL, aunque un sistema ha sido desarrollado que realiza la reconstrucción holográfica de un sujeto fluorescente ^12. Además de la información de volumen tridimensional, MHDL también puede ser utilizado para proporcionar imágenes de contraste de fase cuantitativa ^13, pero que está más allá del alcance de la discusión aquí.

Imágenes de datos Raw Dihm son de dos dimensiones, y en algunos aspectos se parecen a las imágenes de microscopio estándar, aunque fuera de foco. La principal diferencia entre MHDL y microscopía de campo claro estándar está en los anillos de difracción que rodean a los objetos in el campo de vista, que son debido a la naturaleza de la iluminación. MHDL requiere una fuente más coherente que en campo claro – por lo general un LED o láser. Los anillos de difracción en el holograma contienen la información necesaria para reconstruir una imagen tridimensional. Hay dos enfoques principales para la interpretación de datos; MHDL reorientación y adaptación numérica directa. El primer enfoque es aplicable en los casos en que la forma matemática de la figura de difracción se conoce de antemano ^3,4; esta condición se cumple por un pequeño puñado de objetos simples como esferas, cilindros, y los obstáculos semiplano. Montaje directo también es aplicable en los casos en que se conoce posición axial del objeto, y la imagen se puede montar usando una tabla de búsqueda de plantillas de la imagen ^14.

El segundo enfoque (reorientación numérica) es bastante más general y se basa en el uso de los anillos de difracción en la imagen del holograma de dos dimensiones para reconstruir numéricamente el campo óptico enun número de espaciados (arbitrariamente) planos focales en todo el volumen de la muestra. Existen varios métodos relacionados para hacer esto ^6; este trabajo se utiliza el Rayleigh-Sommerfeld volver técnica de propagación según lo descrito por Lee y Grier ^5. El resultado de este procedimiento es una pila de imágenes que reproducen el efecto de cambiar manualmente el plano focal del microscopio (de ahí el nombre de `reorientación numérica '). Una vez que una pila de imágenes ha sido generada, se debe obtener la posición del sujeto en el volumen focal. Una serie de heurísticas de análisis de imágenes, tales como la varianza intensidad local o el contenido de frecuencia espacial, se han presentado para cuantificar la agudeza de enfoque en diferentes puntos de la muestra ^15. En cada caso, cuando se maximiza una métrica imagen en particular (o minimizar), el objeto se considera que está en el foco.

A diferencia de otros sistemas que tratan de identificar a un plano focal particular cuando un objeto es 'in focus', el método en este trabajo escoge points que se encuentran en el interior del objeto de interés, que pueden extenderse a través de una amplia gama de planos focales. Este enfoque es aplicable a una amplia gama de temas y es particularmente adecuado para extendidos, muestras débilmente-dispersión (objetos) de fase, tales como coloides en forma de varilla, cadenas de bacterias o flagelos eucariota. En estas muestras el contraste de la imagen cambia cuando el objeto pasa a través del plano focal; una imagen desenfocada tiene un centro de luz si el objeto está en un lado del plano focal y un centro oscuro si está en el otro. Objetos de fase puros tienen poco o ningún contraste cuando mienten exactamente en el plano focal. Este fenómeno de inversión de contraste ha sido discutido por otros autores ^16,17 y es, en última instancia debido a la fase de Gouy anomalía ^18. Esto ha sido puesto sobre una base más rigurosa en el contexto de la holografía en otros lugares, donde se evalúan los límites de la técnica, la incertidumbre típica de posición es del orden de 150 nm (aproximadamente un pixel) en each Dirección ^19. El método de anomalía fase Gouy es uno de los pocos esquemas Dihm bien definidos para la determinación de la estructura de los objetos extendidos en tres dimensiones, pero sin embargo algunos objetos son problemáticos para reconstruir. Los objetos que se encuentran directamente en el eje óptico (señalando a la cámara) son difíciles de reconstruir con precisión; las incertidumbres en la longitud y la posición del objeto se hacen grandes. Esta limitación se debe en parte a la profundidad de bits restringido de los píxeles de grabación del holograma (el número de niveles de gris diferentes que la cámara puede grabar). Otra configuración problemática se produce cuando el objeto de interés es muy cerca del plano focal. En este caso, las imágenes reales y virtuales del objeto son reconstruidas en estrecha proximidad, dando lugar a campos ópticos complicados que son difíciles de interpretar. Un segundo, un poco menos importante preocupación aquí es que las franjas de difracción resultantes ocupan menos del sensor de imagen, y esta inf más gruesa de granoormación conduce a una reconstrucción de peor calidad.

En la práctica, un filtro de gradiente simple se aplica a los volúmenes tridimensionales reconstruidas para detectar fuertes inversiones de intensidad a lo largo de la dirección de iluminación. Regiones donde la intensidad cambia rápidamente de claro a oscuro, o viceversa, se asocian a regiones de difracción. Objetos débilmente-dispersión se describen bien como una colección que no interactúan de tales elementos ^20, los cuales suma contribuciones individuales para dar al campo dispersado total que se invierte fácilmente utilizando el método de propagación hacia atrás de Rayleigh-Sommerfeld. En este trabajo, la técnica de gradiente de intensidad axial es aplicada a una cadena de células de Streptococcus. Los cuerpos celulares son objetos de fase (la especie de E. coli tiene un índice de refracción medido ²¹ a ser 1,384 a una λ = 589 nm longitud de onda; la cepa de Streptococcus es probable que sean similares) y aparecerá como una cadena de alta intensidad de gotas conectados en ªvolumen de muestra e después del filtro de gradiente se ha aplicado. Métodos de extracción de umbral y característica estándar aplicadas a este volumen filtrado permiten la extracción de píxeles volumétricos (voxels) corresponden a la región dentro de las células. Una ventaja particular de este método es que permite la reconstrucción no ambigua de la posición de un objeto en la dirección axial. Métodos similares (por lo menos, aquellos que registran los hologramas cerca del objeto, fotografiados a través de un objetivo de microscopio) sufren al no poderse determinar el signo de este desplazamiento. Aunque el método de reconstrucción de Rayleigh-Sommerfeld es también firme-independiente en este sentido, la operación de gradiente nos permite discriminar entre objetos de fase débiles por encima y por debajo del plano focal.

Protocol

1. Configuración y Adquisición de Datos Haga crecer una cultura de la cepa de Streptococcus células (natación suave) en medio KTY V4051-197 desde el almacén congelado 22. Incubar en un agitador rotatorio durante la noche a 35 ° C y 150 rpm, a la saturación. Inocular 10 ml de medio KTY fresco con 500 l de la cultura saturada. Incubar durante una 3,5 h más a 35 ° C y 150 rpm hasta que las células alcanzan una densidad óptica de aproximadamente 1,0 en λ = 600 nm (aproxim…

Representative Results

Para demostrar las capacidades de MHDL, los experimentos se realizaron en una cadena de bacterias Streptococcus. La propia cadena mide 10,5 mm de largo, y se compone de 6-7 células esfero-cilíndrica (dos de las células en la cadena están cerca de dividiendo) con diámetros en el intervalo 0,6-1 micras. Las figuras 1a y 1b muestran la interfaz principal de la reconstrucción y el software de renderización. Ejemplos del procedimiento de reorientación numérica se ven en <st…

Discussion

El paso más importante en este protocolo experimental es la captura precisa de las imágenes de un montaje experimental estable. Con los pobres datos de fondo, reconstrucción de alta fidelidad es casi imposible. También es importante evitar lentes de objetivo con un elemento de contraste de fase interna (visible como un anillo oscuro cuando se mira a través de la parte posterior del objetivo), ya que esto puede degradar la imagen reconstruida. El objeto de interés debe ser lo suficientemente lejos del plano focal q…

Materials

Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon Corp.
LED	Thorlabs	M660L3	emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm
LED power supply	Thorlabs	LEDD1B
Thread Adapter	Thorlabs	SM2T2
Thread Adapter	Thorlabs	SM1A2
Frame Grabber board	EPIX	PIXCI E4
High-Speed CMOS camera	Mikrotron	MC-1362