트립신 다이제스트 프로토콜 마우스 모델의 망막 혈관을 분석하는

Summary

트립신 다이제스트 망막 혈관을 분석하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나입니다. 이 원고는 혈관의 전반적인 구조를 유지하면서 기술을 최적화하고 비 혈관 조직을 제거 키 변경 등 세부 방법을 설명합니다.

Abstract

트립신 다이제스트는 망막 혈관 ^1-5 분석하는 황금 표준 방법입니다. 이것은 망막의 비 혈관 구성 요소의 소화 한 후 상호 혈관 채널의 2 차원 평면 마운트를 작성하여 복잡한 3 차원 망막 혈관과 모세 혈관의 전체 네트워크를 시각화 할 수 있습니다. 이것은 하나의 같은 microaneurysms 등 다양한 병리학 적 혈관 변화, 모세 혈관 변성 및 혈관 주위 세포 비율에 비정상적인 내피 세포를 연구 할 수 있습니다. 그러나, 메소드는 때문에 유전자 조작 ^6,7의 용이성의 망막을 연구하는 데 가장 널리 사용되는 동물 모델이 있고, 특히 생쥐에서, 기술적 도전이다. 마우스의 눈에서는 망막 혈관의 전반적인 구조를 유지하면서 완전히 비 혈관 구성 요소를 제거하는 것이 특히 어렵습니다. 지금까지, 세부 사항에 트립신 다이제스트 기술을 설명 문학의 부족이 난마우스를 명. 또한 어려운 단계의 문제를 해결에 대한 도움말을 제공하는 동안이 원고 마우스 망막에 트립신 다이제스트의 자세한 단계별 방법을 제공합니다.

Introduction

망막의 혈관을 시각화하는 등 당뇨 망막 병증 등 다양한 안과 질환의 메커니즘을 해부하는 매우 중요한 방법입니다. 그것은 하나의 microaneurysms, 모세 혈관 변성 및 혈관 주위 세포 손실 ^8,9 등 초기 혈관 이상을 평가할 수 있습니다. 지금까지, 망막 혈관을 분석하기 위해 개발 된 여러 가지 기술이 있었다. 다양한 염료의 혈류가 혈관을 강조하기 위해 사용되었지만, 모두 비슷한 한계를 공유했습니다. 선박 ¹ 파열 및 손상 위험이 높은 압력에서 제공하지 않는 주사는 거의 전체 망막 혈관을 강조합니다. 형광 표지 된 G의 B4 isolectin (; I21413, Invitrogen의, 복합 알렉사 플 루어 594 1:100 희석)와 혈관 내피 세포의 면역 염색 및 망막 평면 마운트하면 혈관의 전반적인 구조를 강조하지만, 모세 혈관의 상세한 시각화, 기저막과 혈관 주위 세포없이 할 수 있습니다 . 그것은에 의해 관찰되었다혈관 정기 산 쉬프 (PAS) 또는 헤 마톡 실린과 에오신 (H & E) 염색을 ^10으로 망막의 평면 마운트 염색에 의해 강조 할 수 Friedenwald. 그러나 염색은 혈관에 비 특이뿐만 아니라 비 혈관 조직을 강조 어려운 혈관을 차별화하고 있습니다. 1960 년대에, 코간와 쿠와 바라보다 쉽게 망막

Protocol

1. 망막 준비

1. 마우스 눈을 명백히. 한 손으로 사용하면 눈이 볼 수 있도록 눈 뚜껑을 엽니 다. 다른 손으로, 곡선 포셉 (곡선에 직면 위쪽)를 사용하여 궤도의 우수하고 열등한 측면에 압력을 세계 돌출 될 때까지. 부드럽게 눈의 후방 측면에서 집게를 닫고 눈을 명백히하는 연속 동작으로 들어 올립니다.
2. 중립 10 %가 최소 24 시간 동안 포르말린에 눈을 고정합니다.
3. 작은 페트리 접시에 PBS 용액에 넣어 눈.
4. 큰 눈물을 유발하지 않도록주의하면서 현미경으로 조심스럽게 망막을 해부하다. 해부 가위로 각막 초기 상처를합니다. 그런 다음, 바로 집게로 잘라 내기 영역을 잡고, 각막을 제거 각막과 공막의 국경을 따라 잘라 가위를 사용합니다. 주의 공막 멀리 시신경으로 망막 맥락막 껍질, 고급 곡선과 직선 집게를 사용. 이 단계는 인내심이 필요합니다신속하게 망막을 해제하면 눈물을 초래할 수 있습니다. 렌즈와 망막 ^{16 일부터} 초과 아이리스와 이물질을 제거합니다.

2. 물은 씻는다

1. 24 잘 접시에 물 (최소 45 μm의 필터로 여과 약 500 μL)와 커버 장소 망막.
2. , 매 30 분 - 1 시간 이상 4-5 ....

Results

성공적인 절차의 최종 제품은 그림 2-4에서와 같이 아키텍처, PAS / 헤 마톡 실린이나 H & E 염색을하거나, 유지와 마우스 망막 혈관의 네트워크 전체의 평면 마운트입니다. 그림 3과 같이 내피 세포와 혈관 주위 세포의 감별법을 볼 수 있습니다. 망막 내피 세포의 핵은 타원형 또는 길쭉한하고 혈관 벽 내에 완전히 거짓말. 혈관 주위 세포의 핵은 작고, 구형, 밀도 얼룩 일반적으로 모세관 벽을 따라 돌출 위치에 있습니다.

트립신 다이제스트는 당뇨병 동물 모델에서 혈관 병리를 분석하는 일반적인 절차입니다. 같은 microaneurysms, 혈관 주위 세포 유령 (혈관 주위 세포 손실 증거), 무세 포성 모세 혈관과 모세 혈관 변성 등의 병리 혈관 병변을 설명하고 있습니다. 그림 4는 DB / DB 마우스에서 볼 모세 혈관 변성 유형에 대한 모델의 예를 보여줍니다 당뇨병. 프로 .......

Discussion

트립신 다이제스트는 망막의 혈관을 평가하는 표준 방법입니다. 불행히도, 기술적으로 도전하고 정확하게 수행이되지 않을 경우, 시료 손실의 높은 비율이 발생할 수 있습니다. 또한, 절차는 안과 질환의 일반적으로 사용되는 유전자 동물 모델에서이 기술의 적용을 제한 할 수있는 마우스에서 특히 어렵습니다. 이 논문은 마우스 눈에 효과적이고 지속적으로 절차를 수행하는 방법에 대한 지침을 제공합니다.

프로토콜 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 망막 혈관 네트워크가 그대로 유지되도록하기 위해, 어떤 큰 눈물을 피하기 위해 조심스럽게 해부하는 것이 중요합니다. 이 트립신 소화 후 쉽게 분리를 용이하게 혈관에서 시신경 층 분리하는 데 도움이 둘째, 여과수의 망막을 세척하는 것은 하룻밤 중요합니다. 이 과정을 촉진 수있는 하나의 수정은 1 %의 세 배에 망막을 배치하는 것톤 X-100은 1 ~ 2 시간 동안 여과 물에 혼합. 그런 다음, 트립신 다이제스트 물 일련의 후 같은 날 수행 할 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
10% 중성 완충 포르말린	Fischer Scientific	SF100-4
Trypsin (1:250)	Amresco	0458-50G	0.1 M Tris TRIZMA base에서 3% 트립신 만들기
	Sigma	T1503-1KG	0.1 M Tris 버퍼 만들기 (pH 7.8 @ 37 ° C)
TRIZMA	Sigma	T3253-500G
Steritop 멸균 진공 병	Millipore	SCGPS05RE	여과수
EQUIPMENT
Dissecting microscope			망막을 잘 시각화할 수 있는 모든 현미경이 적합합니다. (24mm의 작동 거리에서 10배면 충분함)
스트레이트 가위	Fine Science Tools	15024-10	절삭 날 : 8mm; 팁 직경 : 0.2 mm; 10cm
스트레이트 펜치 (Inox)	Dumont # 5	11252-20	Biologie 팁; 0.05 x 0.02 mm; 11cm
곡선 셉트 (Dumostar)	Dumont # 7	11297-10	Biologie 팁; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm
Dubnoff Metabolic Shaker Incubator	Precision Scientific	BDG59442	Shaker 옵션
24 웰 디쉬	Falcon	353047
현미경 슬라이드	폭스바겐	82027-132