Trypsin डाइजेस्ट प्रोटोकॉल एक माउस मॉडल की रेटिना वाहिका संरचना का विश्लेषण करने के लिए
Summary
Trypsin पचाने रेटिना वाहिका संरचना का विश्लेषण करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों में से एक है. यह पांडुलिपि वाहिकाओं के समग्र वास्तुकला जबकि संरक्षण तकनीक का अनुकूलन और गैर संवहनी ऊतक को हटाने के लिए कुंजी परिवर्तन सहित, विस्तार में विधि का वर्णन करता है.
Abstract
Trypsin पचाने रेटिना वाहिका 1-5 विश्लेषण करने के लिए सोने के मानक तरीका है. यह रेटिना के गैर संवहनी घटक के पाचन के बाद परस्पर संवहनी चैनलों की एक दो आयामी फ्लैट माउंट बनाकर जटिल तीन आयामी रेटिनल रक्त वाहिकाओं और capillaries के पूरे नेटवर्क के दृश्य की अनुमति देता है. यह एक ऐसी microaneurysms के रूप में विभिन्न वैकृत संवहनी परिवर्तन, केशिका अध: पतन, और pericyte अनुपात को असामान्य एन्दोथेलिअल अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है. हालांकि, विधि जो क्योंकि आनुवंशिक जोड़तोड़ 6,7 में आसानी से रेटिना अध्ययन करने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपलब्ध पशु मॉडल बन गए हैं, विशेष रूप से चूहों में, तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है. माउस आंख में, यह रेटिना की रक्त वाहिकाओं के समग्र वास्तुकला को बनाए रखते हुए पूरी तरह से गैर संवहनी घटकों को दूर करने के लिए विशेष रूप से कठिन है. तिथि करने के लिए, विस्तार से trypsin पचाने तकनीक का वर्णन करता है कि साहित्य की कमी नहीं है मैंमाउस n. भी मुश्किल कदम समस्या निवारण पर सुझाव प्रदान करते हुए यह पांडुलिपि, माउस रेटिना में trypsin पचाने की एक विस्तृत कदम दर कदम पद्धति प्रदान करता है.
Introduction
रेटिना की वाहिका Visualizing ऐसे मधुमेह रेटिनोपैथी के रूप में विभिन्न नेत्र रोगों के तंत्र को काटना एक अत्यंत महत्वपूर्ण दृष्टिकोण है. यह एक microaneurysms, केशिका अध: पतन, और pericyte नुकसान 8,9 सहित जल्द से जल्द संवहनी असामान्यताएं, का आकलन करने के लिए अनुमति देता है. तिथि करने के लिए, रेटिना वाहिका संरचना का विश्लेषण करने के लिए विकसित कई तकनीकों की गई है. विभिन्न रंगों का छिड़काव जहाजों को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन सभी समान सीमाओं को साझा किया है. जहाजों 1 rupturing और हानिकारक जोखिम जो एक उच्च दबाव में दिया है जब तक कि इंजेक्शन शायद ही कभी पूरे रेटिना वाहिका संरचना पर प्रकाश डाला गया. फ्लोरोफोरे लेबल जी बी 4 isolectin (; I21413, Invitrogen, संयुग्मित एलेक्सा Fluor 594 1:100 कमजोर पड़ने) के साथ संवहनी endothelium के immunostaining और रेटिना फ्लैट आरोह वाहिकाओं के समग्र वास्तुकला पर प्रकाश डाला, लेकिन केशिकाओं का विस्तृत दृश्य, तहखाने झिल्ली और pericytes बिना कर सकते हैं . यह द्वारा नोट किया गया थाजहाजों आवधिक एसिड-Schiff (पीए) या hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला 10 के साथ रेटिना के फ्लैट आरोह को धुंधला से प्रकाश डाला जा सकता है कि Friedenwald. हालांकि, धुंधला वाहिकाओं के लिए गैर विशिष्ट था और साथ ही गैर संवहनी ऊतक पर प्रकाश डाला, यह मुश्किल वाहिकाओं अंतर करने के लिए कर रही है. 1960 के दशक में, कोगन और Kuwabara यह आसान रेटिना 1 की nonvascular घटक पचाने द्वारा रेटिना वाहिका संरचना कल्पना करने के लिए बनाया है कि trypsin पचाने तकनीक विकसित की है. उस समय से, trypsin पचाने रेटिना 2-5 की वाहिका संरचना का विश्लेषण करने में सोने के मानक तरीका बन गया है. हालांकि, यह वाहिका अलग करने के लिए अन्य वैकल्पिक तकनीकों का वर्णन किया गया है कि यह नोट करना महत्वपूर्ण है. आसमाटिक सेल का उपयोग वाहिका अलग और ऊतक 11,12 के जैव रासायनिक अध्ययन की अनुमति के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन प्रक्रिया संरचनात्मक अध्ययन के लिए एक प्राथमिक तरीके के रूप में इस्तेमाल नहीं किया गया. ऊतक प्रिंट विधि कर दिया गया हैmicrovasculature के बड़े क्षेत्रों को अलग किया और vasculature 13 की इलेक्ट्रोटोनिक वास्तुकला का अध्ययन करने की क्षमता देता है. सिद्धांत रूप में, इस तकनीक को भी जहाजों की गुणवत्ता उच्च है, के रूप में संरचनात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लेकिन, यह केवल वाहिका नेटवर्क पूरे के क्षेत्रों को अलग करने में सक्षम है. इन तरीकों trypsin पचाने की जगह नहीं कर सकते हैं, यह वे अलग फायदे और कमियों है और इस संबंध में पूरक हैं यह नोट करना महत्वपूर्ण है.
trypsin पचाने विधि तकनीकी रूप से चुनौती दे रहा है और लगातार 6,7 प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है. इसके अलावा, यह एक इच्छाओं रेटिना 6,7 के समग्र संवहनी वास्तुकला की रक्षा के लिए विशेष रूप से अगर trypsin पचाने में, एक माउस मॉडल पर विशेष रूप से कठिन है कि उल्लेख किया गया है. चुनौतियों की आवश्यकता होती है, (1) वाहिका संरचना के रूप में अच्छी तरह से गैर संवहनी ऊतक दोनों की हानि का कारण बनता है कि रेटिना के ऊपर-पाचन, (2) के तहत पाचन शामिलमें पोत बिस्तर की क्षति, गैर विशिष्ट धुंधला करने के लिए अग्रणी vasculature से गैर संवहनी ऊतक के (3) गरीब जुदाई का नेतृत्व करने के लिए बदल सकती है जो व्यापक यांत्रिक विच्छेदन. कई पांडुलिपियों इन चुनौतियों पर प्रकाश डाला है, लेकिन कोई भी उन्हें 14,15 काबू पाने के लिए एक विस्तृत और संगत प्रोटोकॉल प्रदान की है. इस पांडुलिपि को विशेष रूप से कठिन कदम से निपटने के लिए विशेष टिप्स के साथ माउस और चूहा रेटिना पर trypsin पचाने में प्रदर्शन करने के लिए तकनीक का ब्यौरा एक कदम दर कदम पद्धति को लागू करेगा. एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्र 1 में दिखाया गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trypsin पचाने रेटिना की वाहिका संरचना का आकलन करने के लिए एक मानक तरीका है. दुर्भाग्य से, यह तकनीकी रूप से चुनौती दे रहा है और सही ढंग से प्रदर्शन नहीं अगर नमूना नुकसान की उच्च दर में परिणाम कर सकते हैं. इसके अ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम आंशिक रूप एनआईएच RO1-EY019951 (aaf), दृष्टिहीनता की रोकथाम के लिए इलिनोइस सोसायटी (जेसीसी, AAF), दृष्टिहीनता (RPB) को रोकने के लिए अनुसंधान से नेत्र विज्ञान विभाग को अप्रतिबंधित धन, न्यूयॉर्क और RPB मेडिकल छात्र फैलोशिप अनुदान द्वारा समर्थित किया गया (जेसीसी).
Materials
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 |
References
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
- Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti. Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).
- Danis, R. P., Wallow, I. H. HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).
- Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat. Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).
- Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).
- Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).
- Midena, E., et al. Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio. Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).
- . Chapter 30. Diabetic Retinopathy. , (2005).
- Rosenblatt, B., Benson, W. E., Yannoff, M., Duker, J. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. Ophthalmology. , (2008).
- Friedenwald, J. S. A new approach to some problems of retinal vascular disease. Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).
- Podesta, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).
- Li, Q., et al. Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
