Tripsina Digest protocolo para analisar a vascularização da retina de um rato modelo

Summary

A tripsina é uma compilação dos métodos mais utilizados para analisar a vasculatura retiniana. Este manuscrito descreve o método em detalhes, incluindo alterações importantes para otimizar a técnica e remover o tecido não-vascular, preservando a arquitetura geral dos vasos.

Abstract

Tripsina digest é o método padrão de ouro para analisar a vasculatura retiniana ^1-5. Ela permite a visualização de toda a rede de vasos complexas tridimensionais retina sanguíneos e capilares, criando um bidimensional plana de montagem dos canais vasculares interligados após digestão dos componentes não-vasculares da retina. Isto permite estudar várias alterações patológicas vasculares, tais como a degeneração capilar, microaneurismas, e anormal endoteliais rácios pericyte. No entanto, o método é tecnicamente difícil, especialmente em ratos, que se tenham tornado o modelo animal mais amplamente disponíveis para estudar a retina por causa da facilidade de manipulações genéticas ^6,7. No olho do rato, é particularmente difícil de remover completamente os componentes não-vasculares, mantendo a arquitectura geral dos vasos sanguíneos da retina. Até o momento, há uma escassez de literatura que descreve a técnica de digestão de tripsina em detalhe in o mouse. Este manuscrito fornece uma metodologia detalhada passo-a-passo da tripsina digest no rato retina, além de fornecer dicas sobre solução de problemas etapas difíceis.

Introduction

A visualização da vascularização da retina é uma abordagem extremamente importante para dissecar os mecanismos de várias doenças oculares, tais como retinopatia diabética. Ele permite avaliar as anomalias vasculares, incluindo primeiros microaneurismas, degeneração e perda capilar, pericyte ^8,9. Até à data, tem havido várias técnicas desenvolvidas para analisar a vascularização da retina. Perfusão de vários corantes foi utilizada para realçar os vasos, mas todos têm partilhado limitações semelhantes. Injeção raramente destaca toda a vascularização da retina, a menos dado a uma pressão elevada, o que corre o risco de se romper e danificar os vasos ^1. Imunocoloração do endotélio vascular com fluorophore marcado G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 conjugado; I21413; Invitrogen; 1:100) e monta plano de retina pode-se destacar a arquitetura geral dos vasos, mas sem visualização detalhada dos capilares, membranas basais e pericitos . Foi notada pelosFriedenwald que os navios podem ser destacados pela coloração plana montagens de retina com ácido periódico de Schiff (PAS) ou hematoxilina e eosina (H & E) coloração ^10. No entanto, a coloração não foi específico para os vasos e destacada do tecido não-vascular, bem como, o que torna difícil a diferenciação dos vasos. Na década de 1960, Cogan e Kuwabara desenvolveu a técnica digest tripsina que tornou mais fácil a visualização da vascularização da retina através da digestão dos componentes não-vasculares da retina ^1. Desde essa altura, a tripsina digest tornou-se o método padrão de ouro na análise da vasculatura da retina ^2-5. No entanto, é importante notar que outras técnicas alternativas para isolar a vasculatura tenham sido descritas. A utilização de lise osmótica foi usado para isolar a vasculatura e permitir estudos bioquímicos do tecido ^11,12, mas o procedimento não tem sido utilizada como um método primário para estudo anatómicos. O método de impressão de tecidos tem sidousado para isolar grandes segmentos da microvasculatura e permite a possibilidade de estudar a arquitectura electrotonic da vasculatura ^13. Em teoria, esta técnica também pode ser usada para estudar alterações anatómicas, como a qualidade dos vasos é elevado. No entanto, só é capaz de isolar segmentos de toda a rede vascular. Embora estes métodos não podem substituir a tripsina digest, é importante notar que eles têm diferentes vantagens e desvantagens e são complementares a este respeito.

O método digest tripsina é tecnicamente desafiador e é difícil de executar de forma consistente ^6,7. Além disso, tem sido observado que a tripsina digest é especialmente difícil num modelo de ratinho, especialmente se se deseja preservar a arquitectura global vascular da retina ^6,7. Os desafios incluem (1) sobre-digestão da retina que provoca a perda de ambas a vasculatura, bem como do tecido não-vascular, (2) sub-digestão, requerendoextensa dissecção mecânica que poderia levar a danos do leito do navio, (3) separação deficiente do tecido não vascular a partir da vasculatura levando a coloração não específica. Vários manuscritos têm destacado estes desafios, mas nenhum deles forneceu um protocolo detalhado e consistente para superá-los ^14,15. Este manuscrito irá introduzir uma metodologia passo a passo detalhando a técnica para realizar a digestão da tripsina no rato e rato retinas com dicas específicas sobre o tratamento das etapas particularmente difíceis. Um esquema geral é mostrado na Figura 1.

Protocol

1. Preparação da retina Enuclear o olho mouse. Usando um lado, abrir as pálpebras para que o olho é visível. Com a outra mão, usando uma pinça curva (curvas virada para cima), aplicar pressão sobre aspectos superior e inferior da órbita até que se projeta globo. Com cuidado, feche fórceps no aspecto posterior do olho e levante em um movimento contínuo para enuclear o olho. Corrigir olhos com 10% de formalina tamponada neutra por pelo menos 24 horas. Lugar olho em solução PBS …

Representative Results

O produto final de um processo bem sucedido é um plano de montagem de toda a rede da vasculatura da retina do rato, com a arquitectura mantida, coradas quer com PAS / hematoxilina ou H & E, tal como mostrado nas Figuras 2-4. Limpar a diferenciação das células endoteliais e pericitos pode ser visto como mostrado na Figura 3. Na retina, os núcleos das células endoteliais são ovais ou alongadas e ficar inteiramente dentro da parede do vaso. Pericyte núcleos são pequenos, esfé…

Discussion

Tripsina digest é um método padrão para avaliar a vasculatura da retina. Infelizmente, não é tecnicamente difícil e pode resultar numa elevada taxa de perda de amostra se não for realizado correctamente. Além disso, o procedimento é especialmente difícil, em ratos, o que pode limitar a aplicação desta técnica, os modelos animais genéticos usados ​​de doenças oculares. Este documento fornece orientação sobre como realizar o procedimento de forma eficaz e consistente no rato olhos.

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Materials

			REAGENTS
10% neutral buffered formalin	Fischer Scientific	SF100-4
Trypsin (1:250)	Amresco	0458-50G	Make 3% trypsin in 0.1 M Tris
TRIZMA base	Sigma	T1503-1KG	Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C)
TRIZMA	Sigma	T3253-500G
Steritop sterile vacuum bottle	Millipore	SCGPS05RE	Create filtered water
			EQUIPMENT
Dissecting microscope			Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)
Straight scissors	Fine Science Tools	15024-10	Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm
Straight Forceps (Inox)	Dumont #5	11252-20	Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm
Curved Forcepts (Dumostar)	Dumont #7	11297-10	Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm
Dubnoff Metabolic Shaker Incubator	Precision Scientific	BDG59442	Shaker optional
24-well dish	Falcon	353047
Microscope Slides	VWR	82027-132