JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
면역학 및 감염병학

Karakterisering af inflammatoriske reaktioner under intranasal kolonisering med Streptococcus pneumoniae

Published: January 17, 2014
doi:
10.3791/50490
, , ,
1Department of Pathology and Molecule Medicine,McMaster University

Summary

Kolonisering af murine nasopharynx med Streptococcus pneumoniae og den efterfølgende ekstraktion af vedhængende eller rekrutterede celler er beskrevet. Denne teknik indebærer skylning af nasopharynx og indsamling af væsken gennem nares og kan tilpasses til forskellige udlæsninger, herunder differentialcellekvantificering og analyse af mRNA-udtryk in situ.

Abstract

Nasopharyngeal kolonisering af Streptococcus pneumoniae er en forudsætning for invasion i lungerne eller blodbanen1. Denne organisme er i stand til at kolonisere nasopharynxens slimhindeoverflade, hvor den kan opholde sig, formere sig og til sidst overvinde værtsforsvaret for at invadere til andre væv af værten. Etablering af en infektion i de normalt lavere luftveje resulterer i lungebetændelse. Alternativt kan bakterierne spredes i blodbanen, der forårsager bakterieæmi, som er forbundet med højdødelighed 2, ellers fører direkte til udvikling af pneumokok meningitis. Forståelse af kinetik af, og immunrespons på, nasopharyngeal kolonisering er et vigtigt aspekt af S. lungebetændelse infektion modeller.

Vores musemodel af intranasal kolonisering er tilpasset fra menneskelige modeller3 og er blevet brugt af flere forskergrupper i undersøgelsen af værtspatogenresponser i nasopharynx4-7. I den første del af modellen bruger vi et klinisk isoleret S. pneumoniae til at etablere en selvbegrænsende bakteriel kolonisering, der ligner transporthændelser hos voksne mennesker. Den procedure, der er beskrevet heri, indebærer forberedelse af et bakterielt inoculum efterfulgt af etablering af en koloniseringshændelse gennem levering af inoculumet via en intranasal indgiftsmåde. Residente makrofager er den fremherskende celletype i nasopharynx under konstant tilstand. Typisk er der få lymfocytter til stede i uinficerede mus8, men slimhindekolonisering vil føre til lav- til højkvalitetsbetændelse (afhængigt af virulensen af bakteriearterne og stammen), der vil resultere i et immunrespons og den efterfølgende rekruttering af værtsimmunceller. Disse celler kan isoleres af et toilet af trachealindholdet gennem narerne og korreleres med massefylden af koloniseringsbakterier for bedre at forstå infektionens kinetik.

Protocol

Før du begynder: Alle trin udføres i et biofarvejsniveau 2 (BSL2) Biologisk sikkerhedskabinet (BSC), medmindre andet er angivet. Sørg for, at du har opnået den relevante Biohazard Godkendelse til brug af infektiøse bakterielle patogener i henhold til institutionelle retningslinjer forud for påbegyndelsen af forsøgene. Derudover skal du sørge for, at du har alle de materialer og reagenser, der er nødvendige for at udføre proceduren forberedt på forhånd. Mus, der anvendes i disse eksperimenter …

Representative Results

Figur 1 repræsenterer en oversigt, der opsummerer protokollens hovedtrin. Figur 2-3 giver visualisering af den mikrobiologiske metode, der er forbundet med de protokoller, der er beskrevet heri. Figur 4 repræsenterer korrekt placering af en mus til at udføre en intranasal kolonisering, mens figur 5 skildrer typisk ændringer i vægten af mus koloniseret med S. lungebetændelse stamme P1547. Figur 6-7 repræsenterer specifikke…

Discussion

I denne undersøgelse præsenterede vi detaljerede metoder til intranasal kolonisering af mus ved hjælp af en klinisk isolere stamme af Streptococcus pneumoniae og den efterfølgende isolation og karakterisering af immuncellerne rekrutteret til nasopharynx som reaktion på bakterierne. Vi demonstrerede, hvordan et bakterielt inoculum kan dyrkes i næringsrige medier og bruges til at etablere en koloniseringsbegivenhed hos mus, som oprindeligt er begrænset til nasopharynx. Vi viste derefter, hvordan reagerende …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne takke Dr. Jeffery Weiser fra University of Pennsylvania for hans gave af de kliniske stammer af Streptococcus pneumoniae. Dette arbejde blev finansieret af den canadiske Institutes for Health Research. CV blev finansieret af et M. G. DeGroote stipendium og et stipendium fra canadian Thoracic Society. Dette arbejde blev finansieret af Ontario Lung Association og Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Arbejdet i det buede laboratorium støttes delvist af michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research og McMaster Immunology Research Centre.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number
Anti-Mouse Ly6C FITC BD Pharmingen 553104
Anti-Mouse Ly6G PE BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience 48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC eBioscience 17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 eBioscience 25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience 93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing – PE20 Becton Dickinson 427406
BD 1ml Syringe Becton Dickinson 309659
BD 26G3/8 Intradermal Bevel Becton Dickinson 305110
Buffer RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Difco Tryptic Soy Agar Becton Dickinson 236950
Defibrinated Sheep Blood PML Microbiologicals A0404
RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0253L
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bogaert, D., de Groot, R., et al. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
  2. Kadioglu, A., Weiser, J. N., et al. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
  3. McCool, T. L., Cate, T. R., et al. The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage. J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).
  4. Nelson, A., Roche, A. M., et al. Capsule enhances pneumococcal colonisation by limiting mucus-mediated clearance. Infect. Immun. 75, 83-90 (2007).
  5. van Rossum, A., Lysenko, E., et al. Host and bacterial factors contributing to the clearance of colonisation by Streptococcus pneumoniae in a murine model. Infect. Immun. 73, 7718-7726 (2005).
  6. Barocchi, M. A., Ries, J., et al. A pneumococcal pilus influences virulence and host inflammatory responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2857-2862 (2006).
  7. Malley, R., Henneke, P., et al. Recognition of pneumolysin by Toll-like receptor 4 confers resistance to pneumococcal infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1966-1971 (2003).
  8. McCool, T. L., Weiser, J. N. Limited role of antibody in clearance of Streptococcus pneumoniae in a murine model of colonization. Infect. Immun. 72, 5807-5813 (2004).
  9. Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69 (1), 426-434 (2001).
  10. Jeong, D., Jeong, E., et al. Difference in resistance to Streptococcus pneumoniae infection in mice. Lab Anim. Res. 27, 91-98 (2011).
  11. Wu, H. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  12. Southam, D. S., Dolovich, M., et al. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position. Lung Physiol. 282, 833-839 (2002).
  13. Miller, M. A., Stabenow, J. M., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLoS ONE. 7 (2), (2012).
  14. Briles, D. E., Novak, L. Nasal Colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73 (10), 6945-6951 (2005).
  15. Wu, H. -. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  16. Mo, Y., Wan, R., et al. Application of reverse transcription-PCR and real-time PCR in nanotoxicity research. Methods Mol. Biol. 926, 99-112 (2012).
  17. Kuper, C. F., Koornstra, P. J., et al. The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Trends Immunol. 13, 219-224 (1992).
  18. Zhang, Q., Leong, S. C., et al. Characterisation of regulatory T cells in nasal associated lymphoid tissue in children: relationships with pneumococcal colonization. PLoS Pathog. 7, (2011).
  19. Briles, D. E., Novak, L., et al. Nasal colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73, 6945-6951 (2005).
  20. Weinberger, D. M., Trzcinski, K., et al. Pneumococcal capsular polysaccharide structure predicts serotype prevalence. PLoS Pathog. 5, (2009).
  21. Bryant, W. P., J, , et al. Which Pneumococcal Serogroups Cause the Most Invasive Disease: Implications for Conjugate Vaccine Formulation and Use, Part I.. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
  22. Hausdorff, W. P., Feikin, D. R., et al. Epidemiological differences among pneumococcal serotypes. Lancet Infect. Dis. 5, 83-93 (2005).
  23. Brueggemann, A., Griffiths, D., et al. Clonal Relationships between Invasive and Carriage Streptococcus pneumoniae and Serotype and Clone Specific Differences in Invasive Disease Potential. J. Infect. Dis. 187, 1424-1432 (2003).
  24. Mohler, J., Azoulay-Dupis, E., et al. Streptococcus pneumoniae strain-dependent lung inflammatory responses in a murine model of pneumococcal pneumonia. Intensive Care Med. 29, 808-816 (2003).
  25. Wu, H. Y., Virolainen, A., Mathews, B., King, J., Russell, M. W., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  26. Zhang, Z., Clarke, T. B., et al. Cellular effectors mediating Th17-dependent clearance of pneumococcal colonization in mice. J. Clin. Invest. 119, 1899-1909 (2009).
  27. Parker, D., Martin, F. J., et al. Streptococcus pneumoniae DNA initiates type I interferon signaling in the respiratory tract. MBio. 2, (2011).
  28. Haya, D. L., Camilli, A. Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors. Mol. Microbiol. 45, 1389-1406 (2002).
  29. Nakamura, S., Favis, K. M., et al. Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice. J. Clin. Invest. 121, 3657-3665 (2011).
  30. Kim, J. O., Weiser, J. N. Association of intrastrain phase variation in quantity of capsular polysaccharide and teichoic acid with the virulence of Streptococcus pneumoniae. J. Infect. Dis. 177, 368-377 (1998).
  31. Roche, A. M., King, S. J., et al. Live attenuated Streptococcus pneumoniae strains induce serotype-independent mucosal and systemic protection in mice. Infect. Immun. 75, 2469-2475 (2007).
  32. Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
  33. Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
  34. Richards, L., Ferreira, D. M., Miyaji, E. N., Andrew, P. W., Kadioglu, A. The immunising effect of pneumococcal nasopharyngeal colonisation; protection against future colonisation and fatal invasive disease. Immunobiology. , 215-251 (2010).
  35. Lanie, J. A., Ng, W. L., et al. Genome sequence of Avery’s virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
  36. Robertson, G. T., Ng, W. L., Foley, J., Gilmour, R., Winkler, M. E. Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and. 184, 3508-3520 (2002).
  37. Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
  38. Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Organ-specific models of Streptococcus pneumoniae disease. Scand. J. Infect. D. 35, 647-652 (2003).
  39. Swirski, F. K., Nahrendorf, M., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).

Tags

Streptococcus PneumoniaeNasopharyngeal ColonizationIntranasalInflammatory ResponseImmune ResponseMouse ModelPneumoniaBacteremiaMeningitisResident MacrophagesLymphocytesBacterial Density
check_url/kr/50490?article_type=t&slug=characterization-inflammatory-responses-during-intranasal

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Puchta, A., Verschoor, C. P., Thurn, T., Bowdish, D. M. E. Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae. J. Vis. Exp. (83), e50490, doi:10.3791/50490 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image