Karakterisering av inflammatoriske responser under intranasal kolonisering med streptokokker lungebetennelse
Summary
Kolonisering av murin nasopharynx med Streptococcus pneumoniae og etterfølgende utvinning av tilhenger eller rekrutterte celler er beskrevet. Denne teknikken innebærer å skylle nasopharynx og samling av væsken gjennom nares og er tilpasningsdyktig for ulike avlesninger, inkludert differensialcelle kvantifisering og analyse av mRNA uttrykk in situ.
Abstract
Nasopharyngeal kolonisering av Streptococcus pneumoniae er en forutsetning for invasjon til lungene eller blodbanen1. Denne organismen er i stand til å kolonisere slimhinnens overflate av nasopharynx, hvor den kan ligge, formere seg og til slutt overvinne vertsforsvar for å invadere til andre vev av verten. Etablering av en infeksjon i normalt nedre luftveier resulterer i lungebetennelse. Alternativt kan bakteriene spre seg inn i blodet og forårsake bakterieemi, som er forbundet med høy dødelighet2, eller ellers føre direkte til utvikling av pneumokokk meningitt. Å forstå kinetikken til, og immunresponser på, nasofaryngeal kolonisering er et viktig aspekt av S. lungebetennelse infeksjonsmodeller.
Vår musemodell av intranasal kolonisering er tilpasset fra menneskelige modeller3 og har blitt brukt av flere forskningsgrupper i studiet av vertspatogenresponser i nasopharynx4-7. I den første delen av modellen bruker vi en klinisk isolering av S. pneumoniae for å etablere en selvbegrensende bakteriekolonisering som ligner på vognhendelser hos menneskelige voksne. Prosedyren som er beskrevet her, innebærer forberedelse av et bakteriell inokulum, etterfulgt av etableringen av en koloniseringshendelse gjennom levering av inoculum via en intranasal administrasjonsvei. Residente makrofager er den dominerende celletypen i nasopharynx under steady state. Vanligvis er det få lymfocytter tilstede hos uinfiserte mus8, men slimhinnekolonisering vil føre til lav- til høygradig betennelse (avhengig av virulensen av bakterielle arter og belastning) som vil resultere i en immunrespons og den påfølgende rekrutteringen av vertsimmunceller. Disse cellene kan isoleres av en lavage av trakealinnholdet gjennom nares, og korrelert med tettheten av koloniseringsbakterier for bedre å forstå infeksjonens kinetikk.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien presenterte vi detaljerte metoder for intranasal kolonisering av mus ved hjelp av en klinisk isolerende stamme av Streptococcus pneumoniae og den påfølgende isolasjonen og karakteriseringen av immuncellene rekruttert til nasopharynx som svar på bakteriene. Vi demonstrerte hvordan et bakteriell inokulum kan dyrkes i næringsrike medier og brukes til å etablere en koloniseringshendelse hos mus, som i utgangspunktet er begrenset til nasopharynx. Vi viste da hvordan responderende immuncelletyper …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil takke Dr. Jeffery Weiser ved University of Pennsylvania for hans gave av de kliniske stammene av Streptococcus pneumoniae. Dette arbeidet ble finansiert av Canadian Institutes for Health Research. CV ble finansiert av et M. G. DeGroote-stipend og et fellesskap fra Canadian Thoracic Society. Dette arbeidet ble finansiert av Ontario Lung Association og Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Arbeidet i Bowdish-laboratoriet støttes delvis av Michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research og McMaster Immunology Research Centre.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
| Anti-Mouse Ly6C FITC | BD Pharmingen | 553104 | |
| Anti-Mouse Ly6G PE | BD Pharmingen | ||
| Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 | eBioscience | 48-0453-82 | |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen APC | eBioscience | 17-4801-82 | |
| Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 | eBioscience | 25-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0032-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC | eBioscience | 93-0041-42 | |
| Intramedic Polyethylene Tubing – PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| BD 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| BD 26G3/8 Intradermal Bevel | Becton Dickinson | 305110 | |
| Buffer RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton Dickinson | 236950 | |
| Defibrinated Sheep Blood | PML Microbiologicals | A0404 | |
| RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0253L | |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 |
References
- Bogaert, D., de Groot, R., et al. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., et al. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
- McCool, T. L., Cate, T. R., et al. The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage. J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).
- Nelson, A., Roche, A. M., et al. Capsule enhances pneumococcal colonisation by limiting mucus-mediated clearance. Infect. Immun. 75, 83-90 (2007).
- van Rossum, A., Lysenko, E., et al. Host and bacterial factors contributing to the clearance of colonisation by Streptococcus pneumoniae in a murine model. Infect. Immun. 73, 7718-7726 (2005).
- Barocchi, M. A., Ries, J., et al. A pneumococcal pilus influences virulence and host inflammatory responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2857-2862 (2006).
- Malley, R., Henneke, P., et al. Recognition of pneumolysin by Toll-like receptor 4 confers resistance to pneumococcal infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1966-1971 (2003).
- McCool, T. L., Weiser, J. N. Limited role of antibody in clearance of Streptococcus pneumoniae in a murine model of colonization. Infect. Immun. 72, 5807-5813 (2004).
- Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69 (1), 426-434 (2001).
- Jeong, D., Jeong, E., et al. Difference in resistance to Streptococcus pneumoniae infection in mice. Lab Anim. Res. 27, 91-98 (2011).
- Wu, H. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
- Southam, D. S., Dolovich, M., et al. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position. Lung Physiol. 282, 833-839 (2002).
- Miller, M. A., Stabenow, J. M., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLoS ONE. 7 (2), (2012).
- Briles, D. E., Novak, L. Nasal Colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73 (10), 6945-6951 (2005).
- Wu, H. -. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
- Mo, Y., Wan, R., et al. Application of reverse transcription-PCR and real-time PCR in nanotoxicity research. Methods Mol. Biol. 926, 99-112 (2012).
- Kuper, C. F., Koornstra, P. J., et al. The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Trends Immunol. 13, 219-224 (1992).
- Zhang, Q., Leong, S. C., et al. Characterisation of regulatory T cells in nasal associated lymphoid tissue in children: relationships with pneumococcal colonization. PLoS Pathog. 7, (2011).
- Briles, D. E., Novak, L., et al. Nasal colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73, 6945-6951 (2005).
- Weinberger, D. M., Trzcinski, K., et al. Pneumococcal capsular polysaccharide structure predicts serotype prevalence. PLoS Pathog. 5, (2009).
- Bryant, W. P., J, , et al. Which Pneumococcal Serogroups Cause the Most Invasive Disease: Implications for Conjugate Vaccine Formulation and Use, Part I.. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
- Hausdorff, W. P., Feikin, D. R., et al. Epidemiological differences among pneumococcal serotypes. Lancet Infect. Dis. 5, 83-93 (2005).
- Brueggemann, A., Griffiths, D., et al. Clonal Relationships between Invasive and Carriage Streptococcus pneumoniae and Serotype and Clone Specific Differences in Invasive Disease Potential. J. Infect. Dis. 187, 1424-1432 (2003).
- Mohler, J., Azoulay-Dupis, E., et al. Streptococcus pneumoniae strain-dependent lung inflammatory responses in a murine model of pneumococcal pneumonia. Intensive Care Med. 29, 808-816 (2003).
- Wu, H. Y., Virolainen, A., Mathews, B., King, J., Russell, M. W., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
- Zhang, Z., Clarke, T. B., et al. Cellular effectors mediating Th17-dependent clearance of pneumococcal colonization in mice. J. Clin. Invest. 119, 1899-1909 (2009).
- Parker, D., Martin, F. J., et al. Streptococcus pneumoniae DNA initiates type I interferon signaling in the respiratory tract. MBio. 2, (2011).
- Haya, D. L., Camilli, A. Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors. Mol. Microbiol. 45, 1389-1406 (2002).
- Nakamura, S., Favis, K. M., et al. Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice. J. Clin. Invest. 121, 3657-3665 (2011).
- Kim, J. O., Weiser, J. N. Association of intrastrain phase variation in quantity of capsular polysaccharide and teichoic acid with the virulence of Streptococcus pneumoniae. J. Infect. Dis. 177, 368-377 (1998).
- Roche, A. M., King, S. J., et al. Live attenuated Streptococcus pneumoniae strains induce serotype-independent mucosal and systemic protection in mice. Infect. Immun. 75, 2469-2475 (2007).
- Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
- Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
- Richards, L., Ferreira, D. M., Miyaji, E. N., Andrew, P. W., Kadioglu, A. The immunising effect of pneumococcal nasopharyngeal colonisation; protection against future colonisation and fatal invasive disease. Immunobiology. , 215-251 (2010).
- Lanie, J. A., Ng, W. L., et al. Genome sequence of Avery’s virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Robertson, G. T., Ng, W. L., Foley, J., Gilmour, R., Winkler, M. E. Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and. 184, 3508-3520 (2002).
- Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
- Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Organ-specific models of Streptococcus pneumoniae disease. Scand. J. Infect. D. 35, 647-652 (2003).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
