Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae
Summary
Die Kolonisation des murinen Nasopharynx mit Streptococcus pneumoniae und die anschließende Extraktion von anhaftenden oder rekrutierten Zellen wird beschrieben. Diese Technik beinhaltet das Spülen des Nasopharynx und die Sammlung der Flüssigkeit durch die Nares und ist anpassungsfähig für verschiedene Auslesungen, einschließlich Differentialzellquantifizierung und Analyse der mRNA-Expression in situ.
Abstract
Nasopharyngeale Kolonisation durch Streptococcus pneumoniae ist eine Voraussetzung für die Invasion in die Lunge oder Blutkreislauf1. Dieser Organismus ist in der Lage, die Schleimhautoberfläche des Nasopharynx zu besiedeln, wo er sich aufhalten, sich vermehren und schließlich wirtsabwehren überwinden kann, um in andere Gewebe des Wirts einzudringen. Die Einrichtung einer Infektion in den normalerweise unteren Atemwegen führt zu einer Lungenentzündung. Alternativ können sich die Bakterien in den Blutkreislauf verbreiten und Bakteriämie verursachen, die mit hohen Sterblichkeitsraten verbunden ist2, oder direkt zur Entwicklung von Pneumokokken-Meningitis führen. Das Verständnis der Kinetik und immunioniert auf die nasopharyngeale Kolonisation ist ein wichtiger Aspekt der S. pneumoniae-Infektionsmodelle.
Unser Mausmodell der intranasalen Kolonisation ist an die menschlichen Modelle3 angepasst und wurde von mehreren Forschungsgruppen bei der Untersuchung von Wirtspathogen-Antworten im Nasopharynx4-7verwendet. Im ersten Teil des Modells verwenden wir ein klinisches Isolat von S. pneumoniae, um eine selbstbegrenzende bakterielle Kolonisation zu etablieren, die den Beförderungsereignissen bei menschlichen Erwachsenen ähnelt. Das hier beschriebene Verfahren beinhaltet die Vorbereitung eines bakteriellen Inokulums, gefolgt von der Etablierung eines Kolonisationsereignisses durch Lieferung des Inokulums über einen intranasalen Verabreichungsweg. Residente Makrophagen sind der vorherrschende Zelltyp im Nasopharynx während des stationären Zustands. Typischerweise gibt es nur wenige Lymphozyten in nicht infizierten Mäusen8, aber Schleimhautbesieonisation führt zu niedrigen bis hohen Grad Entzündungen (abhängig von der Virulenz der bakteriellen Arten und Stamm), die zu einer Immunantwort und der anschließenden Rekrutierung von Wirtsimmunzellen führen. Diese Zellen können durch eine Lavage des Trachealinhalts durch die Nares isoliert werden und korrelieren mit der Dichte von Besiedlungsbakterien, um die Kinetik der Infektion besser zu verstehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie präsentierten wir detaillierte Methoden für die intranasale Besiedlung von Mäusen unter Verwendung eines klinischen Isolatestamms von Streptococcus pneumoniae und die anschließende Isolierung und Charakterisierung der Immunzellen, die als Reaktion auf die Bakterien an Nasopharynx rekrutiert wurden. Wir demonstrierten, wie ein bakterielles Inokulum in nährstoffreichen Medien kultiviert werden kann und verwendet werden, um ein Kolonisationsereignis bei Mäusen zu etablieren, das zunächst auf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Jeffery Weiser von der University of Pennsylvania für sein Geschenk der klinischen Stämme von Streptococcus pneumoniae. Diese Arbeit wurde von den Canadian Institutes for Health Research finanziert. CV wurde durch ein M. G. DeGroote Stipendium und ein Stipendium der Canadian Thoracic Society finanziert. Diese Arbeit wurde von der Ontario Lung Association und den Canadian Institutes of Health Research (CIHR) finanziert. Die Arbeit im Bowdish-Labor wird zum Teil von Michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research und dem McMaster Immunology Research Centre unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
| Anti-Mouse Ly6C FITC | BD Pharmingen | 553104 | |
| Anti-Mouse Ly6G PE | BD Pharmingen | ||
| Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 | eBioscience | 48-0453-82 | |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen APC | eBioscience | 17-4801-82 | |
| Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 | eBioscience | 25-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0032-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC | eBioscience | 93-0041-42 | |
| Intramedic Polyethylene Tubing – PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| BD 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| BD 26G3/8 Intradermal Bevel | Becton Dickinson | 305110 | |
| Buffer RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton Dickinson | 236950 | |
| Defibrinated Sheep Blood | PML Microbiologicals | A0404 | |
| RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0253L | |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 |
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