Чувствительным методом для количественной стареющие клетки рака
Summary
Ли старение предотвращает или способствует туморогенез остается спорным. Поскольку химиотерапевтические препараты могут вызывать раковые клетки стареть, изучая старение имеет важное значение для предложения новых методов лечения. Однако, стандартный и широко используется β-галактозидазы анализа представлены основные недостатки. Мы предлагаем здесь Быстрый и чувствительный проточной цитометрии на основе анализа для количественной старения.
Abstract
Клетки человека не бесконечно размножаться. От внешних и / или внутренних сигналов, клетки могут погибнуть или введите стабильной арест клеточного цикла называется старением. Несколько клеточные механизмы, такие, как укорочение теломер и аномальной экспрессии онкогенов митогенных, было показано, что причиной старения. Старение не ограничивается нормальными клетками; раковые клетки Сообщалось также, что стареют.
Химиотерапевтические препараты индуцируют старение в раковых клетках. Однако остается спорным ли старение предотвращает или способствует туморогенез. Как это в конечном итоге может быть конкретного пациента, Быстрый и чувствительный метод оценки старение в раковой клетке вскоре будет необходимо.
Для этого, стандартные β-галактозидазы анализа, используемые в настоящее время методы представлены основные недостатки: она занимает много времени и не чувствительна. Мы предлагаем здесь проточной цитометрии анализа на основе изучения старения на Ливе клеток. Этот тест дает преимущество в том, быстрый, чувствительный, и может быть соединен с иммунного различных клеточных маркеров.
Introduction
С начала шестидесятых годов и его открытия и Хейфликом Moorhead, старение остается сотовая любопытства 1. Клетки человека не бесконечно размножаться и, по старению, Хейфликом и Мурхеде придумал клеточный процесс старения. Старение является стабильным клеточного цикла, в котором клетки остаются метаболически активными по сравнению с клеточной смерти. На сегодняшний день четыре клеточные механизмы, как было показано, чтобы вызвать старение: укорочение теломер, повреждение ДНК, хроматин возмущение, и аномальной экспрессии онкогенов митогенных 2. Это означает, что не только нормальные клетки, но и раковые клетки могут подвергаться старению 3. В самом деле, раковые клетки проходит старение было показано, представляет собой барьер для дальнейшего прогрессирования опухоли 4-5. Тем не менее, в нескольких докладах уже отметили, что, при определенных обстоятельствах, клеточное старение может также способствовать злокачественной 6-7. Изучение старения рака челLs собирается стать желание в исследовании рака в настоящее время используется в качестве химиотерапевтических препаратов может привести к старению раковых клеток не только в пробирке, но и в естественных условиях 8.
Мастер анализа исследовать на наличие стареющих клеток является β-галактозидазы анализа при кислом рН. Это гистохимическую анализа отражает возросшую в лизосомальных биогенеза, происходящих в самых стареющих клеток. Вкратце, экзогенный X-гал, применительно к клеткам, расщепляется с помощью β-галактозидазы, обогащенный лизосомах стареющие клетки, что приводит к синим цветом 9. Синий стареющие клетки могут быть количественно под ярким поле микроскопа. Хотя очень популярны, β-галактозидазы анализа представлены основные недостатки. Во-первых, этот анализ проводят на фиксированных клеток. Во-вторых, это отнимает много времени, потому что оно подразумевает Для количественной оценки степени старения путем подсчета значительно большим числом стареющие клетки под микроскопом. В-третьих, этот анализне чувствительна как дискриминацию между стареющими и не стареющие клетки полностью зависит от наблюдателя.
Здесь мы обсудим неиспользованными, быстрый и чувствительный цитометрии на основе анализа на предмет наличия живых стареющие клетки. Этот анализ основан на гидролизе проницаемые мембраны молекул 5-dodecanoylaminofluorescein ди-β-D-галактопиранозида (C 12-ФДГ), на β-галактозидазы, обогащенный стареющих клеток. После гидролиза и лазерным возбуждением, C 12 ФДГ испускает зеленую флуоресценцию и поэтому могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии, 10, 11. Обнаружение стареющие клетки через проточной цитометрии предлагает большое преимущество, что быстрого и чувствительного. Кроме того, обнаружение стареющих клеток методом проточной цитометрии могут быть связаны с обнаружением других клеточных маркеров. Этот анализ может быть использован для обнаружения стареющих клеток в популяции раковых клетках, обработанных с химиотерапией и может быть обычно установленна срезах тканей, после сотовые диссоциации, в клинике.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представили здесь проточной цитометрии на основе количественного метода определения клеточного старения в живых клетках рака. Этот метод основан на использовании мембраны проницаемой соединения, C 12 ФДГ, и поэтому может быть использован в любом типов клеток и после различных…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим SF 4206 ICORE (Университет Кана) для использования цитометрии объекта. JC получил пост-докторские стипендии Conseil d'де радиационной EDF и советом областного Нижней Нормандии. Эти данные, как часть проектов, финансируемых Ligue Nationale Contre Le Рак – Comités де л'Орн э дю кальвадоса.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
- Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
- Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
- Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
- Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. 암 연구학. 63 (11), 2705-2715 (2003).
- Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
- Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).
