نقص التروية-ضخه نموذج من إصابة الكلى الحاد والتليف آخر الاصابات في الفئران
Summary
نحن تصف نماذج من إصابة الكلى نقص التروية-ضخه التي يسببها المعتدلة والشديدة والتي الفئران الخضوع من جانب واحد الكلوي عنيق لقط تليها في وقت واحد أو تأخر استئصال الكلية المقابل، على التوالي. هذه النماذج تعطي باستمرار يؤدي إلى الفشل الكلوي وتليف بعد الاصابه، ولكن شدة الإصابة والبقاء على قيد الحياة تعتمد على خلفية والعمر والمعدات الجراحية الماوس.
Abstract
يستخدم نقص التروية-ضخه يسببها إصابة الكلى الحاد (IR-آكي) على نطاق واسع كنموذج للآكي في الفئران، ولكن النتائج غالبا ما تكون متغير تماما مع معدلات وفيات عالية، وغالبا ما يتم الإبلاغ عنها والتي قد تربك التحليلات. يستخدم الثنائية الكلوي تحامل عنيق عادة للحث على IR-آكي، لكن الخلافات بين الضغوط المشبك الفعالة و / أو استجابات الكلوي إلى نقص تروية الكلى بين غالبا ما تؤدي إلى نتائج أكثر متغير. وبالإضافة إلى ذلك، ومن المعروف مرات المشبك أقصر للحث على إصابة أنبوبي أكثر متغير، وبينما الفئران التي تمر الإصابة الثنائية مع أوقات المشبك يعد تطوير أنبوبي إصابة أكثر اتساقا، فإنهم غالبا ما يموت في غضون أول 3 أيام بعد الإصابة بسبب قصور كلوي حاد. لتحسين البقاء على قيد الحياة بعد الإصابة والحصول على نتائج أكثر اتساقا ويمكن التنبؤ بها، وقد وضعنا نموذجين من جانب واحد إصابة نقص التروية-ضخه تليها استئصال الكلية المقابل. يتم تنفيذ كل العمليات الجراحية باستخدام نهج الظهرية، والحد من الإجهاد الجراحية الناتجة جمعةROM البطن بطني، وتستخدم عادة لجراحات IR-آكي الماوس. لتحريض إصابة BALB / ج الفئران معتدلة الخضوع من جانب واحد لقط من عنيق الكلوي لمدة 26 دقيقة، والخضوع أيضا استئصال الكلية المقابل في وقت واحد. باستخدام هذا النهج، 50-60٪ من الفئران تطوير معتدلة آكي 24 ساعة بعد الاصابة لكن 90-100٪ من الفئران البقاء على قيد الحياة. للحث على آكي أكثر شدة، والفئران BALB / ج الخضوع عنيق الكلوي لقط لمدة 30 دقيقة تليها استئصال الكلية المقابل بعد 8 أيام الإصابة. وهذا يسمح التقييم الوظيفي للانتعاش الكلوي بعد الإصابة مع بقاء 90-100٪. الضرر أنبوبي بعد الإصابة في وقت مبكر، فضلا عن إصابة آخر التليف هي متسقة للغاية باستخدام هذا النموذج.
Introduction
وقد وضعت مجموعة متنوعة من نماذج تجريبية من إصابة الكلى الحاد (آكي) لتتناسب مع تنوع وتعقيد حالة الإنسان (انظر المرجع لمراجعة حديثة وشاملة 1). كل من هذه النماذج لديه نقاط قوته ونقاط الضعف، وحين يحاكي كل الظروف الإنسانية ذات الصلة مع الكفاءات المتنوعة، لا شيء نموذج بالضبط الفيزيولوجيا المرضية لنظرائهم الإنسان. وقد تم تطوير ضخه نقص التروية (IR) التي يسببها آكي كنموذج للإصابة الكلى نقص التروية الحادة التي يسببها في القوارض. بينما نادرا ما لوحظ من شدة الإصابة أنبوبي كلوي ينظر في هذا النموذج في المرضى الذين يعانون من إصابات نقص انسياب الدم الكلوي 2، على الرغم من قصوره وإلى حد كبير بسبب طبيعة استنساخه نسبيا من هذا الطراز، وفرت الاستخدام الواسع النطاق، ومن المتوقع، وسوف تستمر لتوفير معلومات هامة عن العديد من الآليات المشتركة الأساسية للآكي، والإصلاح، والعلاج 3. جراحة IR يتطلب فامiliarity مع تشريح الكلى الماوس، الذي قمنا موضح في شكل مبسط في الشكل 1. لا يمكن أن يؤديها الكلوي نقص التروية-ضخه (IR) لعملية جراحية إصابة عن طريق النهج بطني (البطن) أو الظهرية (خلف الصفاق). ونحن نستخدم منهج ظهري لأنه هو أقل من صدمة، والسماح أوقات الانتعاش بشكل أسرع وتحسين البقاء على قيد الحياة (وخاصة عند أول تعلم الإجراء). لا يمكن أن يؤديها الكلوي إصابة IR أحاديا أو ثنائيا. ومع ذلك، فإن الاختلافات بين الضغوط فعالة المشبك (التي قد تنجم عن مداخلة من الدهون محيط بالنقير بين فكي المشبك) و / أو الفروق في استجابات الكلوي إلى نقص التروية بين الجانبين يؤدي إلى نتائج أكثر متغير. في حين أن هذا ليس مشكلة مستعصية على الحل، فإنه يمكن زيادة التباين بين التجارب، التي هي قضية رئيسية لهذا النموذج. الأشعة تحت الحمراء من جانب واحد لا يمكن أن يؤديها مع استئصال الكلية مضاد الوحشي. هذا هو أسلوب لدينا من خيار لأنه يقلل من التباين في لقط بين السويقات، والعمل في الوقت نفسه علىllows واحد لتقييم وظائف الكلى، والتي لا تتأثر مع الأشعة تحت الحمراء من جانب واحد وحده. كان هناك نقاش حول ما هي الطريقة الأكثر عملية مقابل المثلى لتقييم وظائف الكلى في الفئران. الدم واليوريا والنيتروجين (بون) يوفر قدرا من وظيفة الكلى وغير مفيد "أول نظرة" علامة في بعض النماذج من آكي، بما في ذلك الضرر الأشعة تحت الحمراء. ومع ذلك، يمكن أن تتأثر مستويات BUN حسب الحالة حجم الفئران التي قد تتأثر، لا سيما في أعقاب نهج بطني إصابة الأشعة تحت الحمراء، عندما يقلل تأخر الانتعاش تناول عن طريق الفم من السوائل لعدة أيام بعد الجراحة. وأقل تأثرا مصل الكرياتينين حسب حالة الماء ولكن يتأثر بشكل واضح من قبل كتلة العضلات. كان واحدا من الصعوبات مع قياسات كرياتينين المصل مشاكل مع الكشف عن chromogens غير الكرياتينين في مصل الفأر باستخدام التقنيات المعتمدة حامض البكريك. وكبديل لذلك، قد وضعت عددا من المراكز إلى أسلوب يعتمد على HPLC لتحديد الكرياتينين الماوس أن لا يتأثر هذا قطعة أثرية 4. ومع ذلك، UNLآيك BUN والكرياتينين البكريك حمض المقايسات، والتي تتطلب فقط 5-10 ميكرولتر من المصل، HPLC-فحوصات تتطلب ~ 25 ميكرولتر مصل في الفحص، التي إذا أجريت في مكررة سيتطلب ~ 100 ميكرولتر من الدم الكامل لكل مقايسة. هذا يمكن أن تكون مقيدة للدراسات الماوس. وقد وضعت بعض المراكز القائمة على الطيف HPLC وقداس طرق أكثر حساسية التي تسمح تحليل عينة أصغر حجم 5، 6. ومع ذلك، هذه التقنيات ليست متاحة على نطاق واسع. وقد تم تقييم بديل، مقايسة تتالي الأنزيمية (الذي يتطلب فقط ميكرولتر 5-10 من المصل) في الفأر والجرذ عينات المصل وأظهرت وثيقة موازية قياسات HPLC من الكرياتينين في مصل الدم في حين فحوصات حمض البكريك دائما القيم الكرياتينين المبالغة في تقدير 7. في حين لا يستخدم على نطاق واسع هذا الاختبار في الأدب آكي، الفحص متاح تجاريا، وسهلة الاستخدام، ونجد يعطي نتائج يمكن الاعتماد عليها مع هذا النموذج من الأشعة تحت الحمراء التي يسببها آكي في الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفنا نموذجين من IR-AKI لدراسة آثار المعتدل والشديد الإصابة الكلوية. هذه النماذج تسمح لنا للحث على إصابة ثابت ويمكن التنبؤ بها مع معدل وفيات منخفض. بروتوكول لدينا تحدد كثيرا من الصعوبات والعثرات ترتبط تقليديا مع هذا النموذج. وعلاوة على ذلك، ونحن قد أظهرت أن اعتمادا على …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم اعتماد مختبر الدكتور دي Caestecker من قبل المعاهد الوطنية للصحة 1RO1 HL093057-01-01 و1RC4DK090770. يتم اعتماد مختبر الدكتور هاريس "من قبل DK38226، DK51265، DK62794 وتمويل من إدارة المحاربين القدامى. الدعم للماوس الكلى جراحات الإصابات والكرياتينين في مصل الدم، وفحوصات التليف قدمت أيضا من قبل فاندربيلت اوبراين الكلى الاصابات مركز منحة 1P30 DK079341.
Materials
| Drug or solution | Company | Catalogue number | Comments |
| Ketamine (anesthetic) | Webster Veterinary | 07-881-9413 (100 mg/ml) | Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine) |
| Xylazine (analgesic) | Webster Veterinary | 07-808-1939 (100 mg/ml) | As above |
| Antisedan (anti-Xylazine) | Webster Veterinary | 07-867-7097 (5 mg/ml) | Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg |
| Buprenorphine (analgesic) | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml) | Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution. |
| Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Betadine swab sticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-01 | |
| Nolvasan Surgical Scrub | Pfizer Animal Care | 300253 | |
| Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery. | |||
| Iris Scissors | Integra Miltex | VWR 21909-404 | For skin and muscle dissection |
| Curved iris forceps | FST | 11065-07 | To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat |
| Blunt forceps | ROBOZ | RS-5228 | To manipulate kidneys |
| Vascular clamp (795 g pressure) | ROBOZ | RS-5459 | Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains |
| Schwartz clip applying forceps | ROBOZ | RS-5450 | For RS-5459 clamps |
| Vascular clamp (75-85 g pressure) | FST | 18055-02 | Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock | FST | 18056-14 | For FST 18055-02 clamps |
| Gayman T/Pump (water-bath heated platform) | Braintree Scientific | TP-650 | The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery |
| 15″ W x 24″ Heated platform | Braintree Scientific | HHP-2 | Connect to Gayman heated water pump |
| Heating pad | Braintree Scientific | Model 39DP | Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery |
| Absorbable suture (Vicryl 5-0) | ETHICON | VCP834G | For fascia and muscle |
| Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B) | CP Medical | CP-B660B-03 | For skin |
| Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm | FST | 12501-13 | To hold suture needles |
| Timer | FST | 06-662-3 | To quantify ischemia time |
| Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol) |
| Electric razor | Braintree Scientific | CLP-22965 | |
| Tape | Durapore | 1538-0 | |
| 1 ml Syringe | EXELint | 26044 | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| Absorbent BenchPad | VWR | 56617-014 | |
| Surgical drapes | VWR | 21902-985 | Need to be autoclaved |
| 2” x 2” Gauze Pads | Medi-First | 60673 | |
| Sterile gloves | Cardinal Health | 2D7251 | |
| Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery. |
References
- Singh, A. P., Junemann, A., Muthuraman, A., Jaggi, A. S., Singh, N., Grover, K., Dhawan, R. Animal models of acute renal failure. Pharmacological reports: PR. 64, 31-44 (2012).
- Heyman, S. N., Rosenberger, C., Rosen, S. Experimental ischemia-reperfusion: Biases and myths-the proximal vs. Distal hypoxic tubular injury debate revisited. Kidney Int. 77, 9-16 (2010).
- Lieberthal, W., Nigam, S. K. Acute renal failure. II. Experimental models of acute renal failure: Imperfect but indispensable. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 278, F1-F12 (2000).
- Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice. Kidney Int. 65, 1959-1967 (2004).
- Yuen, P. S., Dunn, S. R., Miyaji, T., Yasuda, H., Sharma, K., Star, R. A. A simplified method for HPLC determination of creatinine in mouse serum. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286, F1116-F1119 (2004).
- Hetu, P. O., Gingras, M. E., Vinet, B. Development and validation of a rapid liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry (LC-IDMS/MS) method for serum creatinine. Clin. Biochem. 43, 1158-1162 (2010).
- Keppler, A., Gretz, N., Schmidt, R., Kloetzer, H. M., Groene, H. J., Lelongt, B., Meyer, M., Sadick, M., Pill, J. Plasma creatinine determination in mice and rats: An enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71, 74-78 (2007).
- Yang, L., Besschetnova, T. Y., Brooks, C. R., Shah, J. V., Bonventre, J. V. Epithelial cell cycle arrest in G2/M mediates kidney fibrosis after injury. Nat. Med. 16, 535-543 (2010).
- Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122, 462-468 (1986).
- Chawla, L. S., Amdur, R. L., Amodeo, S., Kimmel, P. L., Palant, C. E. The severity of acute kidney injury predicts progression to chronic kidney disease. Kidney Int. 79, 1361-1369 (2012).
- Lo, L. J., Go, A. S., Chertow, G. M., McCulloch, C. E., Fan, D., Ordonez, J. D., Hsu, C. Y. Dialysis-requiring acute renal failure increases the risk of progressive chronic kidney disease. Kidney Int. 76, 893-899 (2009).
- Burne, M. J., Haq, M., Matsuse, H., Mohapatra, S., Rabb, H. Genetic susceptibility to renal ischemia reperfusion injury revealed in a murine model. Transplantation. 69, 1023-1025 (2000).
- Muller, V., Losonczy, G., Heemann, U., Vannay, A., Fekete, A., Reusz, G., Tulassay, T., Szabo, A. J. Sexual dimorphism in renal ischemia-reperfusion injury in rats: Possible role of endothelin. Kidney Int. 62, 1364-1371 (2002).
- Schmitt, R., Marlier, A., Cantley, L. G. Zag expression during aging suppresses proliferation after kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 19, 2375-2383 (2008).
- Oxburgh, L., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion injury of the mouse kidney. Methods Mol. Biol. 886, 363-379 (2012).
