Undersøkelse av<em> Drosophila</em> Larval Tracheal Terminal Cells ved lysmikroskopi
Summary
Her presenterer vi en metode for lysmikroskopi analyse av luftrør terminal celler i<em> Drosophila</em> Larver. Denne metoden tillater en rask undersøkelse av grenen og lumenet morfologi i hele dyr, og vil være nyttig for analyse av individuelle mutanter eller skjermer for mutasjoner som påvirker terminal celle utvikling.
Abstract
Cell formen er kritisk for cellefunksjon. Men til tross for viktigheten av cellemorfologi, er lite kjent om hvordan individuelle celler genererer spesifikke former. Drosophila luftrør terminal celler har blitt et kraftig genetisk modell for å identifisere og belyse rollene til gener som kreves for å generere mobilnettet morfologi. Terminal-celler er en bestanddel av et forgrenet nettverk rørformet, tracheal system som fungerer til å levere oksygen til indre vev. Terminal celler er en utmerket modell for å undersøke spørsmål av cellen form som de har to forskjellige cellulære arkitekturer. Først terminal celler har en forseggjort forgrenet morfologi, i likhet med komplekse nevroner; andre, er terminal celle grener dannet som tynne rør og inneholder en membran-bundet intracellulær lumen. Kvantitativ analyse av terminal celle gren nummer, bransjeorganisasjonen og enkelte bankkontor form, kan brukes til å gi informasjon om rollen til spesifikke genetiske mechanisms i inngåelse av en forgrenet celle. Analyse av røret formasjonen i disse cellene kan avsløre konserverte mekanismer av tubulogenesis felles for andre tubulære nettverk, slik som det vertebrate vaskulatur. Her beskriver teknikker som kan brukes til å raskt fikse, bilde og analysere både forgreninger mønstre og tube dannelse i terminal celler i Drosophila larver. Disse teknikkene kan anvendes for å analysere terminale celler i vill-type og mutante dyr, eller genetiske mosaikk. På grunn av den høye effektiviteten av denne protokollen, er det også godt egnet for genetisk, RNAi-baserte, eller narkotika-skjermer i Drosophila tracheal system.
Introduction
Cell formen er kritisk for funksjonen av individuelle celler i en organisme, så vel som celler som fungerer som en del av et vev eller organ. Vi bruker Drosophila luftrør terminal celler, en komponent av insekt luftveiene, for å undersøke de molekylære mekanismene som deltar i å kontrollere to konserverte typer mobilnettet morfologi: forgrening og tube dannelse (lumenogenesis). Terminal-celler er plassert på tuppen av et nettverk av forgrenede rør som fungerer for å levere oksygen til en indre vev og har et omfattende forgrenet morfologi som avhenger av et FGF signalveien som styres av lokale oksygennivå innenfor målvev 2. Terminal celle grener er tynne rør, med en gassfylt subcellular lumen kjører gjennom hver gren. De forskjellige cellulære arkitekturer av terminal celler, sammen med den enkle der genetiske analyser kan utføres i Drosophila, gjør disse cellene en utmerket modell feller undersøke mekanismer for cellulær utvekst, forgrening, og intracellulær tube formasjon. Terminal celler har vist en nyttig modell for å forstå noen av de signalveier som fører til forgrenet celledifferensiering, utvekst, og modning 2-4. Ved hjelp av dette systemet objektiv, har frem genetiske skjermer for celle morphogenesis mutanter er utført, gir innsikt i mekanismene som styrer cellen form 5,6. For eksempel har disse skjermene vist at en spesifikk RabGAP er nødvendig for cytoskeletal polaritet og vesikkel handel med lumen formasjon og posisjonering 7; som integrin-mediert adhesjon er nødvendig for stabilitet gren 8, og at epitelial PAR-polaritet proteiner regulere polarisert membran handel kreves for både forgrening og lumen dannelse ni. Andre studier i terminal celler har vist at asymmetrisk aktin akkumulering og microtubule organisering er nødvendig for celle tøyelighet og lumenogenesis <sopp 10>. Dermed mangfoldig, konserverte cellebiologiske mekanismer bidrar til terminal celle morphogenesis.
Her beskriver vi en metode for å raskt fikse intakt tredje instar Drosophila larver for analyse av terminal celle forgrening og lumen formasjon. Denne protokollen kan også utføres på både første og annen instar dyr. Nøkkelen til denne teknikk er muligheten til å visualisere terminale celler som er genetisk merket med fluorescerende protein ekspresjon direkte gjennom larvestadiet hårstråene av intakte dyr. Siden denne prosedyren krever ingen post-fiksering manipulasjoner, som antistoffarging, for å observere cellene, det er godt egnet til høy throughput analyser, inkludert genetisk eller narkotika screening. Fluorescerende protein uttrykk viser strukturen av cytoplasmically-fylt grener. Tube dannelse kan overvåkes parallelt med lysfelt mikroskop for å identifisere gassfylte hulrom, som kontrast til det omkringliggende væske-filled vev.
Inkludert i denne protokollen er metoden for å generere genetiske mosaikk basert på den MARCM system 11, for å produsere homozygote mutante terminale celler merket med fluorescerende proteiner i ellers ikke-karakteriserte dyr. Dette er nødvendig, siden terminal celler bare utdype sine komplekse strukturer relativt sent i utviklingen; genetiske mosaikk tillate for bypass av genet krav i andre vev tidligere i utvikling. . Å generere MARCM kloner, er luftrøret merket med luftrør-spesifikk driver andpusten (BTL) 12 Beskrevet her er protokollen for Drosophila X-kromosomet, for andre kromosomer, kan en lignende fremgangsmåte brukes, med genetiske reagenser hensiktsmessig å kromosomet blir undersøkt. Her blir trachea merket ved ekspresjon av en cytoplasmically lokalisert GFP, men prosedyren fungerer like godt med ekspresjon av andre fluorescerende proteiner, slik som DsRed.
I tillegg har vi tatt med en metode for å kvantifisere forgreninger mønstre og lumen dannelse i terminal celler, basert på metoder utviklet for å karakterisere nevrale avdelingskontorer mønstre 13. Denne typen kvantitative data kan være avgjørende i kresne presise rolle gener i forgrening eller lumenogenesis prosessen, samt åpner for direkte sammenligninger mellom ulike mutanter ni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Varmen fiksering teknikken beskrevet her er en rask og praktisk verktøy for bildebehandling Drosophila larve luftrør terminal celler. Her bruker vi denne teknikken til å undersøke forgrening og lumen mønster av vill type celler. Luftrør celler uttrykker GFP, drevet av luftrør promoter andpusten, kan lett visualiseres gjennom larve cuticle etter varme fiksering. De spesifikke forgreninger mønstre av individuelle terminal-celler, så vel som de av de luftfylte hulrom, idet kan raskt visualisert o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Gillian Stanfield for kommentarer til manuskriptet. TAJ støttes av University of Utah Genetics Training Grant T32-GM007464 fra NIH NIGMS.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
- Manning, G., Krasnow, M. A. Development of the Drosophila Tracheal System. The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).
- Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell. 99 (2), 211-220 (1999).
- Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis. Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).
- Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation. PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).
- Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system. PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).
- Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila. 유전학. 176 (4), 2279-2291 (2007).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth. Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).
- Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization. Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).
- Jones, T. A., Metzstein, M. M. A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster. 유전학. 189 (1), 153-164 (2011).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila. Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).
- Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting. Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).
