Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Summary

Dieses Papier zeigt ein Protokoll, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mittels Mikroindentation mit einem Atomic Force Microscope (AFM) zu charakterisieren.

Abstract

Mechanische Eigenschaften der Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM) spielt eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen einschließlich Stammzelldifferenzierung, Tumorentstehung und Wundheilung. Änderungen in der Steifigkeit von Zellen und ECM sind oft Anzeichen von Veränderungen in der Zellphysiologie oder Krankheiten in Geweben. Somit ist Zelle Steifigkeit ein Index, um den Status von Zellkulturen zu bewerten. Unter der Vielzahl von Methoden angewandt, um die Steifigkeit von Zellen und Geweben zu messen, bietet Mikro-Vertiefung mit einem Atomic Force Microscope (AFM) einen Weg, um zuverlässig zu messen die Steifigkeit der lebenden Zellen. Diese Methode wurde in großem Umfang angewendet, um die mikro-Steifigkeit für eine Vielzahl von Materialien, angefangen von Metalloberflächen weichen biologischen Geweben und Zellen zu charakterisieren. Das Grundprinzip dieses Verfahrens ist es, Gedankenstrich eine Zelle mit einer AFM-Spitze aus Geometrie und messen die aufgebrachte Kraft aus der Biegung des AFM-Cantilever. Montage der Kraft-Einzug Kurve nach Hertz-Modusl für die entsprechende Geometrie der Spitze geben können quantitative Messungen der Steifigkeit des Materials. Dieses Papier zeigt das Verfahren, um die Steifigkeit von lebenden Zellen mit AFM charakterisiert. Die wichtigsten Schritte einschließlich des Prozesses der AFM Kalibrierung, Kraft-Kurve Erwerb und Datenanalyse unter Verwendung eines MATLAB Routine demonstriert. Einschränkungen dieser Methode werden ebenfalls diskutiert.

Introduction

Mechanische Eigenschaften, insbesondere Festigkeit, der einzelnen Zellen und der sie umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) sind entscheidend für viele biologische Prozesse wie Zellwachstum, Motilität, Teilung, Differenzierung und Gewebshomöostase. ¹ Es wurde gezeigt, dass die Zelle mechanische Steifigkeit wird hauptsächlich bestimmt durch das Zytoskelett, insbesondere die Netzwerke von Actin und intermediären Filamenten und andere Proteine ​​mit ihnen verbunden sind. ^{2 ergibt sich} aus mechanischen Tests in vitro Netzwerke von Actin und Intermediärfilamenten vermuten, dass die Zelle Mechanik weitgehend abhängig von der Zytoskelett-Struktur und der Vorspannung ist in das Zytoskelett. ^3-5 Steifigkeit von lebenden Zellen wird dann als Index für die Zytoskelett-Struktur ^6, Myosin Aktivität ⁷ und viele andere zelluläre Prozesse evaluieren angesehen. Noch wichtiger ist, sind Veränderungen in der Zelle mechanische Eigenschaften auch oft festgestellt, dass nahe stehendeATED mit verschiedenen Krankheitszuständen wie Tumorbildung und Metastasenbildung ^8-10 Kontrolle der mechanischen Steifigkeit von lebenden Zellen kann daher einen neuen Weg zur Zellphysiologie zu überwachen;. zu erkennen und zu diagnostizieren Krankheiten ^8;. und um die Wirksamkeit der medikamentösen Behandlungen ausgewertet ^{11 , 12}

Mehrere Verfahren, einschließlich Teilchen Tracking Mikrorheologie, ^13-16 magnetischen Verdrehen Zytometrie ¹⁷ Mikropipette Streben ^18,19 und Mikroindentation ^20-22 wurden entwickelt, um die Elastizität der Zellen zu messen. Particle Tracking Mikrorheologie zeichnet die thermischen Schwingungen von entweder Submikron fluoreszierenden Teilchen in Zellen oder Bezugsmarkierungen in der Zelle Zytoskeletts injiziert. ²³ elastischen und viskosen Eigenschaften von Zellen aus den gemessenen Verschiebungen Teilchen mit der Fluktuations-Dissipations-Theorem berechnet. ^14,23 Dieses Verfahren ermöglicht gleichzeitige Messungen der lokalenmechanische Eigenschaften mit hoher räumlicher Auflösung an verschiedenen Orten in einer Zelle. Jedoch kann Einspritzen fluoreszierenden Teilchen in die Zellen auf Veränderungen in der zellulären Funktion, Zytoskelett-Struktur und damit die Zellmechanik führen. Die Mikropipette Aspiration Methode gilt Unterdruck in einer Mikropipette mit einem Durchmesser im Bereich von 1 bis 5 um ein kleines Stück von der Zellmembran in die Pipette saugen. Zelle Steifigkeit von der angelegten Unterdruck und Zellmembran Verformung. ¹⁸ Dieses Verfahren berechnet wird, kann jedoch nicht erkennen, die heterogene Verteilung der Steifigkeit über die Zelle. Magnetische Verdrehen Durchflusszytometrie (MTC) gilt Magnetfeld Drehmoment an superparamagnetische Kügelchen, die an der Zellmembran zu erzeugen. ¹⁷ Handy Steifigkeit wird bei diesem Verfahren aus der Beziehung zwischen der angelegten Drehmoments und der Drehverformung der Zellmembran abgeleitet. Es ist schwierig, die Position der magnetischen Kügelchen in der MTC Verfahren zu steuern, und es ist auch challenging, die Verdrehungsdeformation mit hoher Auflösung zu charakterisieren. Mikroindentation gilt ein Stempel mit wohldefinierten Geometrie in die Zelle zu stanzen. Das Einrücken Kraft und die daraus resultierende Vertiefung in Zellen folgen oft die Vorhersage der Hertz-Modell. Young-Modul von Zellen aus den Kraft-Vertiefung Kurven durch Aufstecken auf die Hertz-Modell berechnet werden. Diese Methode wurde in großem Umfang eingesetzt, um die mechanischen Eigenschaften von Gewebe und Zellen trotz seiner Grenzen wie die Unsicherheit in Kontaktstelle Bestimmung Anwendbarkeit der Hertz-Modell, und das Potential zu Schäden am Zellen zu testen. Unter den vielen Geräten für microindentaion ^20, ist der Atomic Force Microscope (AFM) im Handel erhältlich und wurde in großem Umfang angewendet, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen und Geweben ^21,24-27 charakterisieren.

Dieses Papier zeigt das Verfahren der Verwendung eines Asylum MFP3D-Bio AFM zu Zelle Mechanik charakterisieren. AFM nicht aufly liefert hochauflösende Topographie der Zellen, sondern auch weit verbreitet angewendet worden, um die mechanischen Eigenschaften von Gewebe-Zellen charakterisieren. Das Prinzip der AFM Vertiefung ist in Abbildung 1 dargestellt. Die AFM-Cantilever nähert die Zelle von wenigen Mikrometern über, in Kontakt mit der Zelle; Einzüge die Zelle, so dass die Cantileverauslenkung erreicht einen vorgewählten Sollwert und zieht sich aus der Zelle. Dabei wird die freitragende Auslenkung in Abhängigkeit von seiner Lage aufgezeichnet, wie in Abbildung 1 dargestellt. Vor dem Kontakt mit der Zelle bewegt sich der Ausleger in dem Medium ohne sichtbare Verformung. Wenn Einrücken auf der Zelle, den Freischwinger Kurven und den Ablenksignal zunimmt. Die Ausleger sind als elastische Strahlen, so dass die Auslenkung proportional zu der Kraft, die auf die Zelle modelliert. Durch die Einstellung der maximalen Cantileverauslenkung wird die maximale Größe der Kraft, die auf die Probe beschränkt d vermeidenAmage zu den Zellen. Der Abschnitt der Kraftverlauf von Punkt B nach C in Fig. 1, wobei die Spitze Vertiefungen in die Zelle, an die Hertz-Modell zu passen, um die Zelle zu extrahieren Steifigkeit zeigen.

Abbildung 1. Illustration von AFM Mikroindentation und Interpretation der Kraft-Kurve. Das obere Feld zeigt die Bewegung der AFM-Cantilever durch die Piezo-Scanner gefahren. Die vertikale Lage des Auslegers und der z Cantileverauslenkung D wird während des Verfahrens aufgezeichnet. Der Ausleger beginnt bei Punkt a, wenige Mikrometer über der Zelle. Bei Annäherung an die Zelle, bleibt die Probe Vertiefung δ Null bis Punkt B, wo die Spitze in Kontakt mit der Zelle erreicht. Die Koordinaten des Punktes b in der Handlung sind kritische Wertefür die Datenanalyse durch (z _0, d _0>) bezeichnet. Von B nach C, die Cantilever-Einzüge in die Zelle, bis die Cantileverauslenkung erreicht einen Sollwert, der auf das Verhältnis zwischen der maximalen gezielte Eindruckkraft und Kragfeder Konstante sein wird. Sobald die Auslenkung Signal erreicht den vorgegebenen Maximalwert, wird der Ausleger dann aus der Zelle zu Punkt d, wo es oft nach unten durch Spitze-Probe Haftung gezogen werden zurückgenommen, löst sich von der Zelle und kehrt in seine ursprüngliche Lage am e. Das rechte Bild zeigt die Beziehung zwischen der Vertiefung und dem aufgezeichneten z und d-Signals. In der unteren linken Bereich ist eine graphische Darstellung eines repräsentativen Kraftverlauf, die maximale Vertiefung eines Auslegers, der die Federkonstante gemessen werden 0.07N / m ist, ist auf 17 nm, so dass die maximale Eindruckkraft anzuwendenden Probe ist 1,2 nN. Die wichtigsten Orten während der Vertiefung sind markiert.

Protocol

1. Kalibrieren Sie die Federkonstante der Cantilever Legen Sie den Ausleger in die AFM gemäß den Anweisungen des Herstellers. Es ist notwendig, die Cantileverhalters mit Ethanol gereinigt vor allen Experimenten. Dies wird Ihnen helfen zu begrenzen bakterielle Kontamination der Kultur in den AFM-Messungen. Kalibrieren InvOLS (Inverse Optical Lever Sensitivity). Dieser Parameter beschreibt die Menge der Photodiode Antwort (Volt) pro Nanometer Cantileverauslenkung. Legen Sie einen sauberen …

Representative Results

2a zeigt drei repräsentative Kraftkurven von 3T3 Fibroblasten auf Kunststoff-Oberfläche, Polyacrylamidgel von Young-Module 3.000 Pa und 17.000 Pa bzw. kultiviert gemacht. Nach sorgfältiger Ermittlung der Kontaktstellen in den Kurven wird das Einrücken Kraft als Funktion der Zelle Verformung in 2b dargestellt. Unter einer Kraft von Größenordnungen kleiner als 0,3 nN, eine Pyramidenform Spitze Spiegelstriche 3 Mikrometer in einer Zelle auf einer 3 kPa Polyacrylamidgel kultiviert. Im…

Discussion

Die AFM Vertiefung Methode hat Vorteile gegenüber mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen zu charakterisieren. Wenn auch weniger empfindlich als die magnetische Verdrehen Durchflusszytometrie und optische Pinzette, die Kräfte auf die Pikonewton Stufe ³² messen kann, kann die AFM Widerstandskraft von Proben im Bereich von zig Pico-Newton, um Hunderte von nano-Newton, vergleichbar zu erfassen, um der Kraft reichen, dass Zellen können unter Verwendung einer Mikropipette ¹⁹ aufgebracht werden…

Materials

Atomic Force Microscope

Asylum Research

MFP3D-BIO