Den<em> I ovo</em> CAM-analysen som en Xenograftmodel for Sarkom
Summary
Den<em> I ovo</em> Chorioallantoic membran (CAM) er podet med ferske sarkom-deriverte tumorvev, deres encellede suspensjoner, og permanente og forbigående fluorescensmerkede etablerte sarkom cellelinjer. Modellen brukes til å studere pode-(levedyktighet, Ki67 spredning indeks, nekrose, infiltrasjon) og vert (fibroblast infiltrasjon, vaskulær ingrowth) atferd.
Abstract
Sarkom er en meget sjelden sykdom som er heterogen i naturen, alle hindre utviklingen av nye behandlingsformer. Sarkom pasienter er ideelle kandidater for personlig medisin etter lagdeling, forklarer den nåværende interesse i å utvikle en reproduserbar og rimelig xenotransplant modell for denne sykdommen. Den dama chorioallantoic membranen er en naturlig immunodeficient vert i stand til å opprettholde podet vev og celler uten artsspesifikke restriksjoner. I tillegg er det lett tilgjengelig, manipulert og avbildes ved hjelp av optisk og fluorescens stereomikroskopi. Histologi tillater ytterligere detaljert analyse av heterotypic cellulære interaksjoner.
Denne protokollen beskriver i detalj i ovo pode av chorioallantoic membran med ferske sarkom-avledet tumorvev, deres encellede suspensjoner, og permanente og forbigående fluorescensmerkede etablerte sarkom cellelinjer (SAOS-2 og SW1353). Den dama overlevelse rottees er opptil 75%. Modellen brukes til å studere pode-(levedyktighet, Ki67 spredning indeks, nekrose, infiltrasjon) og vert (fibroblast infiltrasjon, vaskulær ingrowth) atferd. For lokaliserte poding av encellede suspensjoner, gir ECM gel betydelige fordeler fremfor inerte containment materialer. Den Ki67-indeks spredning er relatert til avstanden av cellene fra overflaten av CAM og varigheten av programmet på CAM, idet sistnevnte bestemme en tidsperiode for tilførsel av terapeutiske produkter.
Introduction
Sarkom er en sjelden svulst av bindevev med en høy dødelighet som følge av behandling motstand 1,2. Fremgang i pasientens overlevelse er hemmet av deres lave årlig insidens, deres bredt mangfold, og det faktum at sarkom celler er rapportert å være vanskelig å kultur in vitro 3,4.
Bruk av dyrkede celler for preklinisk terapi evaluering har avdekket at nye, tilsynelatende aktive molekyler in vitro ikke alltid gjenspeiler resultatene i klinisk setting. Videre genom avvik avdekket av genuttrykk arrays er ikke alltid korrelert til tumor adferdstrekk hos den enkelte pasient 5-7. For å prøve og løse disse problemene, har personlig medisin fått stadig større betydning, noe som gjenspeiles i økt søk etter xenograft modeller 8-12.
Et in vivo-forsøk har fordelen av å reflektere det komplekse samspill mellom cancer celler og verten vev miljø i solide svulster, er nødvendig for kreft spredning og invasjon 13. For tiden vi studerer bruken av Chorio-Allantoic Membrane assay (CAM-analyse) som en reproduserbar xenograft modell for sarkom 14,15. Denne analysen er mye brukt for studiet av tumor angiogenese 16,17. I litteraturen, har vi imidlertid funnet forskjellige protokoller for denne analysen, mens andre studier observert en markert forskjell i veksten eller angiogenese i henhold til forskjellige protokoller 18,19.
I denne artikkelen undersøker vi effekten av varierende forhold i CAM-analysen på celle atferd med svulst grafts, tumor-avledet encellede suspensjoner og etablerte sarkom cellekulturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tid for vaksinasjon og innhøsting
Timing dagen for vaksinasjonen ble utført ved hjelp av SAOS2 i ECM gel (36 CAM) og varierte mellom embryonale utvikling dag 5 og 10 år.
Før inkubasjon dag 9, var CAM ikke konsekvent stor nok til å støtte ECM gel vi søkte. Ved innhøsting, kreftceller noen ganger måtte hentes fra dypere CAM, og noen ECM gel prøvene ble liggende løs i albumen eller på CAM. På dag 5 og 6, var det vanskelig å unngå å sette kreftceller på…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Celler fra SW1353 chondrosarcoma cellelinje ble vennlig levert av professor dr. PCW Hogendoorn og professor Dr. J. Bovee av Leiden University, Nederland. Vi takker J. Mestach og G. Wagemans for utmerket teknisk assistanse, og G. De Bruyne for den profesjonelle tegning av oversikt over protokollen vår.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 |
| G418 | Invitrogen | 11811031 |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 |
| PBS | Invitrogen | 20012019 |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech | |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
References
- Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
- Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas. Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).
- Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. Cancer statistics, 2001. CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).
- Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).
- Taylor, B. S., Barretina, J., et al. Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).
- Skubitz, K. M., D’Adamo, D. R. Sarcoma. Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).
- Nielsen, T. O., West, R. B. Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm. Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).
- Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).
- DeRose, Y. S., Wang, G., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Bertotti, A., Migliardi, G., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts (“xenopatients”) identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Decaudin, D. Primary human tumor xenografted models (‘tumorgrafts’) for good management of patients with cancer. Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Sys, G., Van Bockstal, M., et al. Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model. Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).
- Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines. 암 연구학. 42, 1826-1837 (1982).
- Deryugina, E., Quigly, J. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).
- Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).
- Balke, M., Neumann, A., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Research Notes. 3, 58 (2010).
- Hendrix, A., Maynard, D., et al. Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).
- Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels. American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).
- Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).
- Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).
- De Wever, O., Hendrix, A., et al. Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices. International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).
- Albini, A., Benelli, R. The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).
- Hanahan, D., Coussens, L. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
