ロイシンリッチの代謝標識は、放射性リン酸キナーゼ1および2を繰り返します
Summary
ロイシンリッチリピートキナーゼ1および2（LRRK1およびLRRK2）は、GTPアーゼおよびキナーゼドメインの両方をコードし、細胞内でリン酸化されたマルチドメインタンパク質である。ここでは、それによってその全体的なセルラphophorylationレベルを測定する手段を提供する、32 Pオルトリン酸を用いて細胞内LRRK1とLRRK2を標識するためのプロトコルを提示する。
Abstract
ロイシンリッチリピートキナーゼ1および2（LRRK1およびLRRK2）は、セリン – スレオニンキナーゼドメイン、複合タンパク質ドメインのラス（ROC）、ROCドメイン（COR）のC-末端を含め、同様のドメイン構成を共有パラログであるおよびロイシンリッチとN末端にアンキリン様リピート。 LRRK2は、パーキンソン病3,4の病因に関与している間LRRK1およびLRRK2の正確な細胞の役割は、しかしLRRK1は、1,2シグナリングチロシンキナーゼ受容体に関与しているまだ解明されてきた。本稿では、それによって細胞におけるこれら2タンパク質の全体的なリン酸化レベルを測定する手段を提供し、32 Pオルトリンを持つ細胞にLRRK1とLRRK2タンパク質を標識するためのプロトコルを提示する。簡潔には、親和性はLRRKタ ンパク質は32 P-オルトリン酸を含有する培地に曝露されたHEK293T細胞において発現されるタグ付き。 32 P-オルトリンはわずか後の細胞に同化されているインキュベーション時間およびリン酸塩を含有する細胞内の全ての分子は、それによって放射性標識されている。親和性タグを介して（3XFLAG）LRRKタンパク質は免疫沈降により、他の細胞成分から単離される。免疫沈降物をSDS-PAGEによって分離し、PVDF膜および組み込まれたリン酸塩の分析にブロットは、ブロット上のタンパク質のオートラジオグラフィー（32 P信号）およびウエスタン検出（タンパク質シグナル）によって行われる。プロトコルは、容易に細胞内で発現され、免疫沈降によって単離することができる任意の他のタンパク質のリン酸化を監視するように適合させることができる。
Introduction
ロイシンリッチリピートキナーゼ1および2（LRRK1およびLRRK2）は、同様のドメイン構成を共有するマルチドメインパラログである。両タンパク質は、効果的ROCOタンパク質ファミリー5,6に両方のタンパク質を分類、分子量GTPase（複合体タンパク質のRasは、またはROC）のRasファミリーだけでなく、ROCドメイン（COR）のC末端に似アーゼ配列をコードする。 ROC-CORドメインタンデムのN末端 のみLRRK2は、余分なアルマジロdomein 6-8をコードしている間、両 方のタンパク質は、ロイシンリッチリピートドメインだけでなく、アンキリン様ドメインをコードする。 ROC-CORのC末端のみLRRK2がC末端領域8のWD40ドメインをコードしながら、両方のタンパク質は、セリン-トレオニンキナーゼドメインを共有する。 LRRK1およびLRRK2の正確な細胞の役割は、しかしLRRK1 1,2シグナリングチロシンキナーゼ受容体に関係している、解明されていたが、パーキンソン病の3,4の病因にLRRK2の役割への遺伝的証拠を指しています。
<pクラスは、= "jove_content">タンパク質のリン酸化は、細胞内での一般的な制御機構である。例えば、リン酸化は、酵素の活性化またはシグナル伝達複合体へのタンパク質の動員に必須であることができる。 LRRK2の細胞のリン酸化は広範に特徴付けされており、phosphositeマッピングはアンキリンリピートとロイシンリッチリピートドメイン間でクラスタ9月11日で発生する細胞のリン酸化部位の大部分を示している。 LRRK1細胞のリン酸化部位をマッピングするには至っていないものの、COS7細胞から免疫沈降LRRK1タンパク質のブロットのリンタンパク質染色を用いた研究からの証拠は、LRRK1タンパク質が細胞12内のリン酸化されていることを示唆している。本論文では、32 P-オルトリンで代謝標識を使用した細胞株において、LRRK1とLRRK2の一般的なリン酸化レベルを測定するための基本的なプロトコルを提供します。全体的な戦略は簡単です。親和性はLRRK proteタグインは、32 P-オルトリン酸を含有する培地に曝露されたHEK293T細胞において発現される。 32 P-オルトリンインキュベーションのわずか数時間後に細胞に同化され、リン酸塩を含有する細胞内の全ての分子は、それによって放射性標識されている。親和性タグ（3XFLAG）を次に免疫沈降によって他の細胞成分からLRRKタンパク質を単離するために使用される。免疫沈降物をSDS-PAGEによって分離し、PVDF膜および組み込まれたリン酸塩の分析にブロットは、ブロット上のタンパク質のオートラジオグラフィー（32 P信号）およびウエスタン検出（タンパク質シグナル）によって行われる。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、32 P-オルトリンで代謝標識を使用した細胞株において、LRRK1とLRRK2の一般的なリン酸化レベルを測定するための基本的なプロトコルを提供します。全体的な戦略は簡単です。親和性はLRRKタ ンパク質は32 P-オルトリン酸を含有する培地に曝露されたHEK293T細胞において発現されるタグ付き。 32 P-オルトリンインキュベーションのわずか数時間後に細胞に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々はまた、この研究をサポートしているマイケル·J·フォックス財団に感謝しています。フランダースFWO（FWOプロジェクトG.0666.09、JMTの主任研究員フェローシップ）、IWT SBO/80020プロジェクト神経ターゲットKUルーベン（OT/08/052AとIOF-KP/07 / 001） – 私たちは、研究財団に感謝彼らのサポートのため。この研究はまた、JMTにキングボードウィン財団が運営するファンドDruwé-Eerdekensによって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11971-025 | This medium contains no phosphates |
| Anti Flag M2 affiinty gel | Sigma | A2220 | For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426. |
| Extra thick blotting filter | Bio-Rad | 1703965 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 |
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