Metabólica Rotulagem de Leucina rico Repita Kinases 1 e 2 com Radioactive Fosfato
Summary
Leucina repetição rica quinases 1 e 2 (e LRRK1 LRRK2) são proteínas de vários domínios que codificam tanto GTPase e domínios cinase e que são fosforiladas em células. Aqui, apresentamos um protocolo para rotular LRRK1 e LRRK2 em células com 32 P-ortofosfato, proporcionando assim um meio para medir seus níveis gerais de fosforilação celular.
Abstract
Leucina repetição rica quinases 1 e 2 (e LRRK1 LRRK2) são parálogos que partilham uma organização do domínio semelhante, incluindo um domínio de serina-treonina cinase, um complexo de Ras de proteínas de domínio (ROC), um C-terminal do domínio ROC (CR), e repetições de anquirina-como no N-terminal rica em leucina e. As funções celulares precisas de LRRK1 e LRRK2 ainda tem de ser esclarecida, no entanto LRRK1 tem sido implicada na sinalização do receptor de tirosina-quinase de 1,2, enquanto LRRK2 está implicada na patogénese da doença de Parkinson 3,4. Neste relatório, apresentamos um protocolo para identificar as proteínas LRRK1 e LRRK2 em células com 32 P-ortofosfato, proporcionando assim um meio para medir os níveis globais de fosforilação destas duas proteínas nas células. Em resumo, proteínas marcadas com afinidade LRRK são expressos em células HEK293T, que estão expostos a meio contendo 32 P-ortofosfato. A 32 P-ortofosfato é assimilado pelas células depois de apenas algunshoras de incubação e todas as moléculas na célula contendo fosfatos são, assim, marcado radioactivamente. Através da etiqueta de afinidade (3xflag) as proteínas LRRK são isolados a partir de outros componentes celulares por imunoprecipitação. Os imunoprecipitados são então separados por meio de SDS-PAGE, transferido para membranas de PVDF e análise dos fosfatos incorporados é realizada por auto-radiografia (32 sinal P) e de detecção de western (sinal de proteína) das proteínas sobre as manchas. O protocolo pode ser facilmente adaptado para monitorar a fosforilação de qualquer outra proteína que pode ser expresso em células e isolado por imunoprecipitação.
Introduction
Leucina rico repetição quinases 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) são parálogos vários domínios que partilham uma organização de domínio semelhante. Ambas as proteínas de codificar uma sequência de GTPase semelhante à família Ras de GTPases (Ras de proteínas complexas, ou ROC), bem como um C-terminal do domínio ROC (CR), de forma eficaz classificando ambas as proteínas para a família de proteínas ROCO 5,6. N-terminal do domínio em tandem ROC-COR, ambas as proteínas codificar um domínio de repetição rica em leucina, bem como um domínio de anquirina semelhante, ao passo que apenas LRRK2 codifica um tatu adicional Domein 6-8. C-terminal de ROC-COR, ambas as proteínas partilham um domínio de cinase de serina-treonina, enquanto apenas LRRK2 codifica um domínio WD40 na região C-terminal 8. As funções celulares precisas de LRRK1 e LRRK2 ainda tem de ser esclarecida, no entanto LRRK1 tem sido implicada na sinalização do receptor de tirosina-quinase de 1,2, enquanto que a evidência genética aponta para um papel para LRRK2 na patogénese da doença de Parkinson 3,4.
<pclasse = "jove_content"> A fosforilação de proteínas é um mecanismo de regulação comum em células. Por exemplo, a fosforilação pode ser essencial para a activação de enzimas ou para o recrutamento de proteínas de um complexo de sinalização. A fosforilação celular de LRRK2 foi extensivamente caracterizado e mapeamento phosphosite mostrou uma maioria dos locais de fosforilação celular ocorra em um agrupamento entre a repetição de anquirina e leucina ricos domínios de repetição 9-11. Embora LRRK1 locais de fosforilação celular ainda tem de ser mapeada, evidências a partir de estudos utilizando coloração fosfoproteína de manchas de proteína LRRK1 imunoprecipitada a partir de células COS7 sugere que a proteína LRRK1 é fosforilado nas células 12.Este documento fornece um protocolo básico para ensaio geral do nível de fosforilação LRRK1 e LRRK2 em linhagens de células usando marcação metabólica com 32 P-ortofosfato. A estratégia global é simples. Afinidade marcado LRRK proteins são expressos em células HEK293T, que estão expostos a meio contendo 32 P-ortofosfato. A 32 P-ortofosfato é assimilada pelas células depois de apenas algumas horas de incubação e todas as moléculas na célula contendo fosfatos são, assim, marcado radioactivamente. O marcador de afinidade (3xflag) é então usado para isolar as proteínas LRRK de outros componentes celulares por imunoprecipitação. Os imunoprecipitados são então separados por meio de SDS-PAGE, transferido para membranas de PVDF e análise dos fosfatos incorporados é realizada por auto-radiografia (32 sinal P) e de detecção de western (sinal de proteína) das proteínas sobre as manchas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este documento fornece um protocolo básico para ensaio geral do nível de fosforilação LRRK1 e LRRK2 em linhagens de células usando marcação metabólica com 32 P-ortofosfato. A estratégia global é simples. Afinidade proteínas marcadas LRRK são expressos em células HEK293T, que são expostos a meio contendo 32 P-ortofosfato. A 32 P-ortofosfato é assimilada pelas células depois de apenas algumas horas de incubação e todas as moléculas na célula contendo fosfatos são, assi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Também somos gratos à Fundação Michael J. Fox apoiar este estudo. Agradecemos à Fundação de Pesquisa – Flandres FWO (projeto FWO G.0666.09, companheirismo pesquisador sênior para JMT), o projeto Neuro-TARGET navegação fluvial SBO/80020, a KU Leuven (OT/08/052A e IOF-KP/07 / 001) por seu apoio. Esta pesquisa também foi apoiado em parte pelo Fundo Druwé-Eerdekens geridos pela Fundação Rei Balduíno para JMT.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11971-025 | This medium contains no phosphates |
| Anti Flag M2 affiinty gel | Sigma | A2220 | For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426. |
| Extra thick blotting filter | Bio-Rad | 1703965 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 |
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