Visualisering av eksperimentelle data har blitt et sentralt element i å presentere resultatene til det vitenskapelige samfunn. Generering av levende intervallopptak av voksende embryo bidrar til bedre presentasjon og forståelse av komplekse utviklingsprosesser. Denne protokollen er en steg-for-steg guide til celle merking via photoconversion av kaede protein i sebrafisk.
Virveldyr palatogenesis er en svært koreograferte og komplekse utviklingsprosess, som innebærer flytting av kranie neural crest (CNC) celler, konvergens og utvidelse av ansikts prominenser, og modning av kraniofaciale skjelettet. Å studere bidraget fra kranie neural crest til spesifikke regioner av sebrafisk ganen en sox10: kaede transgen sebrafisk linjen ble generert. Sox10 gir lineage begrensning av kaede rapportørprotein til neural crest, og dermed gjøre cellen merking en mer nøyaktig måte enn ved tradisjonell fargestoff eller reporter mRNA injeksjon. Kaede er en foto-konvertible protein som svinger fra grønt til rødt etter bilde aktivering og gjør det mulig å følge celler presist. De sox10: kaede transgene linjer ble brukt til å utføre avstamning analyse for å avgrense CNC celle populasjoner som gir opphav til overkjevens versus underkjevens elementer og illustrerer homologi av ansikts prominenser til amniotes. Denne protokollen beskriver trinns for å generere en live time-lapse video av en sox10: kaede sebrafisk embryo. Utvikling av ethmoid plate vil fungere som et praktisk eksempel. Denne protokollen kan brukes til å lage en time-lapse confocal opptak av noen kaede eller lignende photoconvertible reporter protein i transgen sebrafisk. Videre kan den brukes til å fange opp ikke bare normalt, men også unormal utvikling av craniofacial strukturer i sebrafisk mutanter.
Orofacial kløfter representerer den mest utbredte kraniofaciale misdannelse, med 1/700-1, 000 leveranser påvirket en. Forstyrrelse av tidlig embryologisk kraniofaciale utvikling kan føre til dannelse av leppe-og ganespalte (CL / P). Mens årsaker til syndrom kløft har vært i stor grad vist, genetiske og epigenetiske baser av nonsyndromic former for orofacial clefting fortsatt trenger å bli avdekket 2-4. For å forstå den etiologi og patogenese av disse deformasjoner, er det nødvendig å klargjøre utvikling av craniofacial strukturer på cellebasis.
I alle virveldyr arter hjerne neural crest cellene (CNCC) migrere fra dorsal nevralrøret å fylle svelg buer, som vil bidra til dannelsen av orofacial strukturer. Forstyrrelse av tidlig embryologisk neural crest utvikling kan føre til dannelse av kraniofaciale misdannelser inkludert CL / P 5-7.
I annonsendition til strukturelle likheter mellom sebrafisk og pattedyr kraniofaciale utvikling (CNCCs bor i homologe regioner), er genet regulatoriske nettverk svært konservert. Det har også blitt vist at CNCCs utvikles på samme måte mellom amniote arter og sebrafisk 8, noe som gjør en kraftig sebrafisk organisme for studiet av utviklings-og genetiske basis av CL / P. Det har mange fordeler, blant annet liten størrelse, rask og ex-utero embryoutvikling, og høye reproduksjons. Videre er embryo optisk transparent, slik at det er mottagelig for observasjon av komplekse utviklingshendelser i mikroskop 9.. Det er en ideell dyremodell for studiet av migrasjon og differensiering av kranie neural crest cellene.
Utvider på tidligere publiserte arbeider 8, 10, 11, den vandrende mønster av CNCC ble beskrevet i detalj ved hjelp av sox10: kaede transgen modell 5. Kaede er en foto-konvertible protein som tuRNS fra grønt til rødt etter fotoaktivering og gjør det mulig å spore CNCCs presist. I løpet av denne transformasjonen peptid ryggrad spaltes, noe som tyder på at konverteringen er stabil, noe som betyr at cellene kan spores til sin endelige destinasjon 12. Transgene linjer merket med kaede henhold transcriptional kontroll av sox10 viste at amniote gane og ethmoid plate av sebrafisk er dannet homologously ved fusjon av bilaterale overkjevens prominenser (MXP) med frontonasal prominens (FNP) og at Y-formet fusjon søm er analogt mellom arter.
Blant andre programmer, de sox10: ble kaede transgen sebrafisk modell brukes til å generere videoer av sebrafisk embryo på ulike utviklingsstadier vise dannelsen av normale og unormale kraniofaciale strukturer. Photoconversion av spesifikke grupper av celler gjør det mulig å følge utviklingen av disse. Med denne metoden en tilnærming for å skape levende avbildning av å utvikle craniofacial strukturer i sebrafisk er innført, noe som gjør det enkelt å visuelt demonstrere dette komplekset utviklingsprosess.
Denne protokollen er rettet mot å dele opplevelsen av å generere disse videoene ved hjelp av den normale utviklingen av ethmoid plate i sox10: kaede transgen sebrafisk som et eksempel. Denne protokollen kan videre brukes til å lage time-lapse videoer av noen struktur avledet fra kranie neural crest cellene i sebrafisk.
Her en ny metode for visualisering av kraniofaciale utvikling i sebrafisk-modellen vises. De sox10: kaede transgen sebrafisk linje har blitt brukt for å beskrive den vandrende mønster av CNCC i detalj er brukt som modellorganisme fem.
Tidligere studier har brukt brutto landemerker som øyet å målrette celler og har stolt på kaede mRNA injeksjon, photoconversion analyser eller bur fluorescein dekstran for photoconversion 10, 11, 14, 15 Sox:. 10 kaede transgen linje …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Robert Kelsh for vennlig deling sebrafisk sox10 promoter reagens.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
sox10: kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
Petri dishes 100×15 mm | BD Falcon | 351029 | |
Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |